The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Todos los ratones utilizados en estos estudios fueron ratones CD-1 obtenidos de Charles River Laboratories. Experimentos de cultivo anteriores también se han realizado en otras cepas, tales como C57BL / 6J (datos no presentados), pero cualquier cepa se puede utilizar. Hembras adultas embarazadas fueron de aproximadamente 2-3 meses de edad y se sacrificaron mediante inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical y toracotomía bilateral antes de la eliminación del embrión. Los animales fueron alojados de conformidad con las directrices del NIH, y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati. 1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo y Platos <ol><li> Preparar una solución de etanol al 70%. Agua desionizada Autoclave (para la fabricación de cámaras humidificadas y para hacer soluciones / dilución). Esterilizar las herramientas de disección (pinzas, tijeras, y 27 g jeringas de aguja) rociando abajo con etanol al 70%. </li><li> PrepararSolución salina tamponada con fosfato 10X (PBS) que contiene calcio y magnesio (80 g NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml de 1 M CaCl 2, 3,75 ml de 1 M de MgCl 2 ). Revuelva para disolver en 1 l de agua estéril en autoclave y luego filtrar con papel de filtro. Diluir 10 veces con agua para hacer 1X PBS. </li><li> Heat inactivar suero bovino fetal (FBS) a 55 ° C durante 30 min y el filtro de esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 micras. </li><li> Preparar 38 ml 1X medio de cultivo completo (llamado DMEM completo, cDMEM), que consiste en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 10% filtró dilución FBS inactivado por calor y un centésimo de penicilina-estreptomicina de valores. Esto por lo general se debe utilizar fresco, pero se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes. </li><li> Reconstituir el VEGFR tirosina quinasa Inhibidor II (TKI II) en DMSO para una concentración de solución madre de 5 mg / ml, y diluir la acción con cDMEM para hacer una solución de trabajo. El aire acondicionado de últimacentración para este estudio es 1,875 g / ml en cDMEM. De acuerdo a las recomendaciones de la empresa, soluciones de reserva son estables durante un máximo de 6 meses a -20 ° C. En cuanto a las soluciones de trabajo, hacer fresco y utilización en el mismo día. Nota: La concentración de este fármaco en la solución de trabajo debe ser de dos veces mayor que la concentración final deseada (ya que se diluirá de dos veces en la gotita). Al mismo tiempo, preparar el mismo volumen de cDMEM que contiene el mismo volumen de DMSO para el tratamiento de &quot;control&quot;. </li><li> Preparar los reactivos de digestión cola (NaOH 50 mM y 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) por separado en agua destilada. </li><li> Hacer un balance de los cebadores de PCR XY 25 M (XY adelante 5&#39;-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 &#39;y 5&#39; XY Reverse-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3 &#39;) junto con agua libre de nucleasa. </li><li> Preparar tampón 50X TAE (242 g Base Trizma, 57,1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,5, y añadir agua a 1 l fivolumen final). Preparar tampón de corrida TAE 1X (20 ml 50X TAE diluyó con agua hasta 1 L de volumen total). </li><li> Para crear una solución al 2,5% de agarosa (0,625 g de agarosa, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml de agua), solución de agarosa de calor en el microondas hasta que hierva, luego dejar enfriar hasta alrededor de 55 a 65 ° C (capaz de tocar). Una vez frío, añadir 2 l de solución de bromuro de etidio 1%, y se vierte en gel. ¡CUIDADO! El bromuro de etidio es un mutágeno y teratógeno; por favor, utilice guantes de nitrilo y adecuado protocolo de seguridad al manejar. Alternativamente, se pueden usar otros agentes o colorantes gel de resolución potencialmente menos tóxicos. </li><li> Preparar solución de bloqueo (PBS con 0,1% Triton X-100, 10% de suero bovino fetal [FBS], y 3% de albúmina de suero bovino [BSA]) para inmunofluorescencia. </li><li> Preparar la solución de lavado (PBS con 0,1% Triton X-100, 1% de FBS, y 3% de BSA) para inmunofluorescencia. </li><li> Preparar PbTx (PBS con 0,1% Triton X-100) para inmunofluorescencia. </li><li> Preparar las cámaras de incubación para culture. Llenar platos grandes (100 mm de diámetro) de Petri con 35 ml de agua en autoclave. Coloque cerca del lugar donde se llevará a cabo la disección y culturas. </li></ol> 2. Aislamiento de Fetal Testículos de Mus musculus <ol><li> Compruebe el ratón hembra de tapones vaginales cada mañana. Mediodía en el día en el que se detecta el tapón vaginal se considera E0.5. La eutanasia del ratón hembra embarazada en E11.5, de una manera consistente con los animales protocolos aprobados. </li><li> Rocíe abdomen del ratón con etanol al 70%. </li><li> Abra la piel del vientre y el peritoneo con una incisión en forma de V con unas tijeras finas y tire hacia atrás colgajo de tejido para exponer los órganos interiores. </li><li> Localice los ovarios en ambos extremos de la trompa uterina. Con unas tijeras, corte en el ovario y el tejido conectivo para separar el útero que contiene los embriones desde el cuerpo de la madre. </li><li> Abra la pared uterina cortando suavemente el lado opuesto a la placenta, la exposición de las bolsas de la yema. Sea cuidadoso para no pusaco vitelino ncture para evitar embriones dañar o perder. </li><li> Cortar cerca de la placenta para eliminar las bolsas de la yema contiene embrión y colocarlos en un plato que contiene PBS con calcio y magnesio. La presencia de iones de calcio y magnesio ayudará a moléculas de adhesión celular apoyo para mantener la arquitectura del tejido e impiden que el tejido se pegue a las herramientas de disección. </li><li> Con unas pinzas, retire el saco vitelino y amnios del embrión mediante la punción con cuidado el saco vitelino para crear un agujero en el que el embrión se puede deslizar hacia fuera. Una vez que el embrión se encuentra fuera del saco vitelino, cortar el cordón umbilical. </li><li> Desde este punto en adelante, utilizar un microscopio ubicado en una campana de cultivo de tejido estéril. Retire la cabeza del embrión y deseche pellizcando con pinzas a cada lado del cuello. </li><li> Retire la cola y colocar en un nuevo tubo de microcentrífuga para el análisis XY PCR para determinar el sexo del embrión. Nota: Si bien es óptimo para gónadas cultura tan pronto como sea posible después de la cosecha, también es possible para eliminar ADN de la cola y realizar XX / XY genotipado antes del cultivo, de modo que el sexo de cada embrión es conocido y sólo el sexo deseado tiene que ser cultivado. Si bien la determinación del genotipo se está haciendo, los embriones pueden mantenerse separados (de modo que puedan ser seguidos) a 4 ° C o en hielo hasta que esté listo para la cultura. Una advertencia es que este periodo fuera en el útero o condiciones de cultivo puede afectar potencialmente a la viabilidad de la cultura o el desarrollo posterior durante el cultivo. </li><li> Asegurar el embrión en una posición supina en contra de la parte inferior de la placa de cultivo fijando las axilas de embrión con un par de pinzas (por lo general el fórceps mantenidos en la mano débil). Mantener estas pinzas en lugar de mantener el embrión quieto durante todo el proceso de disección. </li><li> Con otro par de pinzas, quite la piel del abdomen y cubre eliminar suavemente el hígado, los intestinos y otros órganos para exponer la pared posterior del cuerpo. </li><li> Como las gónadas se encuentran en la pared del cuerpo de vuelta a cada lado de la aorta dorsal,un vaso sanguíneo grande que recorre la línea media del cuerpo, cucharada por debajo de la cresta urogenital con pinzas cerradas y retire la cresta urogenital mediante la apertura de la pinza y levantando. Como las gónadas serán libremente fijadas a la pared, tenga cuidado de no tirar demasiado rápido sin quitar estas conexiones o las gónadas pueden estirar, causando daños a los órganos. </li><li> Mueva la cresta urogenital en cDMEM en un plato para aclimatarse tejido para los medios de comunicación. </li><li> Separar el complejo gónada-mesonefros del resto de la cresta urogenital utilizando 27 g agujas. Use una aguja para cortar presionando hacia abajo, y utilizar la otra para guiar el tejido correctamente para permitir la separación óptima. Evite el uso de un movimiento de aserrado contra el fondo del plato, como agujas afiladas crearán fragmentos de plástico que se adhieren a los tejidos. Asegúrese de mantener el mesonefros completamente unidos a la gónada. </li></ol> 3. El cultivo de gónadas con un inhibidor de molécula pequeña <ol><li> Establecer dos 20 μl pipetas a 15 l cada uno. Cortar unos 1-2 mm de una de las puntas de pipeta de barrera utilizando una hoja de afeitar limpia, esterilizada para la transferencia de las gónadas y además del control cDMEM, mientras que la otra pipeta se utilizará únicamente para cDMEM tratado con el fármaco. </li><li> Alinear gónadas con su eje longitudinal paralelo a la punta de la pipeta por lo que fácilmente se pueden pipeta con la punta de corte. Tenga cuidado de las gónadas se pegan en el interior de la punta de pipeta. </li><li> Etiquetar un lado como la gotita de control y el otro como la gotita que contiene el fármaco. Sólo dos gotitas pueden caber en una tapa de placa de 35 mm. Asegúrese de que las etiquetas de los párpados se ajustan a las etiquetas de los tubos de microcentrífuga que contiene la cola de los tejidos. </li><li> Pipeta 15 l de cDMEM que contienen una sola gónada en una gotita en la tapa de una pequeña (35 mm) placa de cultivo (utilizar sólo las tapas, ya que los fondos son demasiado alto para caber dentro de una cámara humidificada placa de Petri). Coloque dos gotas que contienen las gónadas-separadas a ambos lados del plato, fr bien separadoom uno del otro. Compruebe bajo el microscopio para asegurar que las gónadas se han transferido a las gotas. </li><li> Para la gotita designado como el control, agregar un adicional de 15 l de cDMEM que contienen DMSO (realizada en el paso 1.5) para hacer una gota con un volumen total 30 l. Utilice sólo la pipeta &quot;control&quot; que no va a ponerse en contacto con la droga. </li><li> Para la otra gotita (muestra tratada con fármaco), añadir 15 l de TKI-II que contiene cDMEM para hacer una gota con un volumen total de 30 l. Utilice sólo la pipeta designado para las muestras tratadas con el fármaco. </li><li> Usando la pipeta, extender las gotas en un patrón circular expansión hasta que estén cerca de 15-18 mm de diámetro y la gónada se encuentra aproximadamente en el centro. Orientar la gónada para que quede en su lado y la gónada y mesonefros son fácilmente distinguibles. Orientar el pulmón de manera que los dos lóbulos en posición plana. <ol><li> Aunque diámetro de gota puede variar ligeramente, asegúrese de que las gónadas no son floating y se mantiene en su lugar por la tensión superficial. Asegúrese de que las gotitas no se toquen entre sí o con el lado de la tapa. Sin la tensión de la superficie, los órganos crecerán en la tapa durante el cultivo y aplanar, distorsionando así la morfología de órganos. </li></ol></li><li> Colocar con cuidado la tapa de la placa de cultivo que contenía las gotitas en posición vertical sobre la superficie del agua en el grande (100 mm) plato humidificador. Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas debajo de la parte inferior de la tapa y que está acostado sobre la superficie del agua. No invierta la tapa y tener cuidado de no dejar que el agua toque la parte superior de la tapa donde se encuentran las gotas. </li><li> Para crear una pequeña cámara húmeda, cubrir inmediatamente con la tapa del plato humidificador grande para encerrar las culturas gónadas. Actuar lo más rápidamente posible para minimizar cualquier evaporación de medios de comunicación. Asegúrese de que el plato más pequeño tiene espacio entre ella y la tapa del plato más grande para moverse libremente; de lo contrario, la condensación puede hacer un sello y bel intercambio de aire de bloqueo para el tejido. </li><li> Una vez que dos pequeñas tapas se colocan en la cámara, coloque inmediatamente la cámara en la incubadora. Incubar las culturas de gotas durante 48 horas en un humidificado incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li></ol> Reacción en Cadena de la Polimerasa 4. para determinar el sexo de los embriones <ol><li> Añadir las colas embrionarias para fondo de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir a cada tubo 200 l de NaOH 50 mM. </li><li> Coloca a 95 ° C durante 15 minutos o hasta que el tejido se haya disuelto completamente. </li><li> Añadir 50 l de 1 M Tris-HCl y agitar ligeramente y brevemente. </li><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, hacer una mezcla maestra de PCR fresca multiplicando cada volumen por el número total de muestras: 0,5 l de 25 mM solución Primer, 2,5 l de 10X Taq Buffer, 0,5 l mM dNTPs 10 (nucleótidos), 19,3 l nuclease- agua libre, 0,2 l de ADN polimerasa Taq. Mezclar bien. </li><li> Añadir 23l de mezcla maestra de PCR a PCR tubos que contienen 3 l de lisado de colas digeridos. </li><li> Tubos Flick para mezclar ellos, a continuación, realizar un breve centrifugado para llevar las muestras a la parte inferior del tubo. </li><li> Ejecutar XY programa (Short) PCR (Tabla 1). </li><li> Cargar las muestras (con tinte 5x) y la escalera en un gel de agarosa al 2,5% en tampón TAE 1X. </li><li> Ejecute la electroforesis en gel de agarosa hasta XX y XY bandas se pueden resolver. </li><li> Imagen del gel con la captura de imágenes de luz UV y. </li><li> Analizar el X-cromosoma específico vs Y bandas del cromosoma específico (cromosoma X = 331 pares de bases [pb] y XY = 302 pb) 13; XY muestras (masculinas) tendrán dos bandas de 331 y 302 pb, mientras XX (femeninos) muestras aparecerán como una única banda de 331 pb. </li></ol> 5. Toda la inmunofluorescencia Monte Organ Día 1: <ol><li> Retire las gónadas de la cultura con una pipeta 1.000 l con una punta de corte. Si se desea, pueden estarcolocado en un plato de PBS para lavar medios y reactivos. Coloque en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. El tamaño de tubo más pequeño conservará reactivos y hacer más fácil hacer un seguimiento de las muestras en el tubo. <ol><li> Asegúrese de mantener el control y las muestras tratadas, así como muestras XX y XY, en tubos separados y eliminarlos de la cultura con conjuntos separados de pipetas para evitar la contaminación potencial de drogas. </li></ol></li><li> Lávese las gónadas dos veces con PBS. A partir de ahora, este protocolo puede utilizar 1X PBS que carecen de calcio y magnesio. Para lavar ellos, permiten que las gónadas para hunden hasta el fondo del tubo (por gravedad) y luego eliminar el líquido anteriormente. Tenga cuidado de no perder gónadas pipeteando demasiado cerca de ellos. </li><li> Eliminar la mayor cantidad PBS como sea posible desde el tubo. Añadir 250 l de paraformaldehído al 4% en PBS que contenía 0,1% de Triton X-100, y dejar incubar O / N a 4 ° C en un agitador. Alternativamente, esta fijación se puede realizar durante 2 horas a 4 ° C en un agitador. ¡CUIDADO! Paraformaldehyde es una sustancia tóxica, por lo que sigue el protocolo de seguridad al manejar. </li></ol> Dia 2: <ol start="4"><li> Enjuague las gónadas dos veces en 250 l PbTx a RT. </li><li> Lávese las gónadas 3 veces con 250 l PbTx durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Bloquee las gónadas al menos 1 hora en 250 l de solución de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Teñir las gónadas O / N a 4 ° C en un rockero en 250 l de anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo. </li></ol> Día 3: <ol start="8"><li> Enjuague las gónadas dos veces en 250 Solución de lavado l. </li><li> Lávese las gónadas 3 veces con 250 l solución de lavado durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en una mecedora. </li><li> Bloquee las gónadas 1 h en 250 ml de solución de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Cubra el tubo de microcentrífuga con papel de aluminio para proteger secundaria de anticuerpos fluorescentes de la luz. </li><li> Incubar las gónadas 04.02 horas a RT en arocker en 250 l de anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo que contiene Hoechst 33342. Alternativamente, realice anticuerpo secundario y Hoechst 33342 incubación O / N a 4 ° C en eje de balancín. </li><li> Enjuague las gónadas dos veces en 250 l PbTx. </li><li> Lávese las gónadas 3 veces en 250 l PbTx durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Usando una punta de pipeta de corte, transferir gónadas en un portaobjetos con el líquido mínimo. Retire el exceso de líquido con la pipeta, pero asegúrese de que el tejido no se seque. </li><li> Orientar las gónadas en forma deseada con unas pinzas, y añadir rápidamente una gota de medio de montaje para montar las gónadas de la diapositiva. Asegúrese de que los abrigos de los medios de montaje todas las muestras por completo; es fundamental para evitar que las muestras se sequen. </li><li> Use cubreobjetos (número 1.5 del estilo) de tamaño adecuado para cubrir suavemente muestras. Deje de montaje propagación medios de comunicación para ponerse en contacto con toda la superficie del cubreobjetos. Si es necesario, pulse muy ligeramente en las esquinas de modo que el cubreobjetosno hay grandes burbujas de aire. </li><li> Sellar las diapositivas con claro esmalte de uñas en los bordes para reducir la evaporación de los medios de montaje. Tienda diapositivas montadas en la oscuridad a 4 ° C. </li></ol>

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Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este estudio demuestra un método ex vivo gotita entera órgano que tiene muchas aplicaciones potenciales para el estudio del desarrollo fetal. Esta técnica se puede utilizar para múltiples órganos, y permite al investigador para abordar cuestiones biológicas que son difíciles de examinar usando enfoques in vivo debido a la inaccesibilidad de los embriones y el potencial letalidad embrionaria. Este método de cultivo tiene beneficios adicionales sobre otros enfoques in vitro, tales como l...

La regeneración de órganos in vivo en los seres humanos es muy limitada; Por lo tanto, la ingeniería de tejidos, el desarrollo de tejidos y órganos a partir de células individuales donados por un anfitrión, se está convirtiendo en una terapia potencial atractivo para el reemplazo de órganos. Sin embargo, para que esta estrategia terapéutica para tener éxito, los factores y las interacciones celulares implicados en la morfogénesis del órgano deben ser estudiados a fondo y bien entendidos. Debido a la incapacidad para estudiar el desarrollo de los órganos específicos con los enfoques tradicionales, los investigadores han recurrido a embrión conjunto alternativo o cultivos de órganos enteros. Kalaskar et al. 1 han demostrado que la cultura embriogénesis ex vivo toda produce resultados comparables (en el 58% de los embriones cultivados) en el desarrollo del útero, lo que sugiere que los métodos de cultivo ex vivo son una alternativa viable para los estudios de organogénesis. Un sistema de cultivo de órganos individualizado, como este ex vivo droPlet sistema de cultivo, permite el análisis de órganos conjunto independiente de los efectos sistémicos, al tiempo que permite la manipulación de una vía de señalización específica o interacciones celulares a través de la adición de reactivos farmacológicos o anticuerpos. Tradicionalmente, el estudio de desarrollo de los órganos del feto se ha limitado a las tecnologías transgénicas y knockout de ratón, además de reactivos farmacológicos entregados por vía materna. Sin embargo, hay cuestiones técnicas que implican estas técnicas y tratamientos in vivo; la mayoría de las preocupaciones giran en torno a los efectos de influir en varios órganos simultáneamente que a menudo resulta en letalidad embrionaria. Una preocupación adicional de estudios de manipulación de desarrollo fetal farmacológicamente es el efecto materno de los fármacos sobre el desarrollo embrionario in utero (por ejemplo, el metabolismo maternal de la droga antes de que alcance el embrión) y si tales reactivos pueden pasar a través de la barrera placentaria. La técnica de cultivo de órganos toda describióaquí fue adaptada de un protocolo descrito por primera Maatouk et al. 2, en la que las gónadas fetales enteros se incuban en cultivos ex vivo de gotas en posición vertical. Una ventaja significativa de cultivo de gónadas fetales es que los inhibidores de molécula pequeña pueden acceder fácilmente todo el órgano por difusión simple. . DeFalco et al han demostrado que la utilización de este método de cultivo gotita ex vivo en combinación con inhibidores de molécula pequeña se puede utilizar para estudiar los procesos y las interacciones que se producen durante el desarrollo de las gónadas 3 de señalización; estos procesos serían difíciles de examinar in vivo debido a problemas técnicos (por ejemplo, el paso de drogas a través de la placenta o letalidad de afectar a múltiples órganos utilizando enfoques genéticos o farmacológicos). La cultura gotita no es sólo una mejora en algunos aspectos más de la experimentación en el útero, pero también es una mejora con respecto in vitro y ex visistemas vo también. El uso de líneas celulares para estudiar la morfogénesis es extremadamente difícil porque carecen de los diversos tipos de células, carecen de la matriz extracelular (ECM) componentes críticos que permiten la formación de la arquitectura de órganos, y pueden exhibir artefactos en las cascadas de señalización. Aunque la ingeniería de tejidos ha hecho mejoras significativas en la creación de andamios que simulan ECM, la falta de conocimiento con respecto a la cual las señales son requeridos por cada tipo de célula durante la organogénesis hace que sea difícil para construir un sistema de órganos in vitro. Otros sistemas ex vivo han sido establecidos previamente para estudiar la organogénesis, o más específicamente la morfogénesis y han sido muy exitoso para imágenes en vivo de los órganos fetales en agar 4, transwells 5, 6, filtros y otras matrices de andamio 7,8. La ventaja del sistema de cultivo gotita es que permite el estudio de la morfogénesis, proporcionando la capacidad de utilizar menos reactivos, que son often caro, pero también dando la tensión superficial de órganos, lo cual es importante para el crecimiento y la señalización de capacidades 9. En el ratón, la morfogénesis inicial testículo tiene lugar entre embrionario (E) etapas E11.5 y E13.5; estas etapas comprenden la ventana de tiempo óptimo para los factores que influyen en la diferenciación de sexo-específicas de instrucción. Entre los procesos críticos que ocurren durante la formación de los testículos son la generación de la arquitectura cable de testículo y la formación de una red vascular-testículo específico. La utilización de este órgano vivo todo el sistema de cultivo ex gotita, uno es capaz de alterar la vascularización-masculina específica e inhibir la morfogénesis testículo mediante el uso de un inhibidor de pequeña molécula que bloquea la actividad de los receptores de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); La remodelación vascular mediada por VEGF es crítico para el desarrollo testicular 10-12. Esta técnica se puede aplicar con éxito a otros órganos y puede apuntar tiempo específicoventanas de desarrollo. Formación de imágenes de órganos Todo el montaje permite la visualización de las estructuras vitales así como los cambios estructurales y celulares resultantes de la administración de diversos inhibidores. Es importante destacar que este sistema es ventajoso en que el investigador puede pasar por alto posibles efectos de confusión de la administración del fármaco materna o la interrupción sistémica in vivo durante estrategias gen diana. Por lo tanto, todo este órgano ex vivo sistema de cultivo de gota puede mejorar significativamente la capacidad de entender las interacciones y la señalización que se producen específicamente en determinados órganos durante el desarrollo fetal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Strip 0.2 mL PCR Tubes &#38; Detached Flat Caps</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T3218-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1096FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with 27gauge needles</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;M PES syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO14S-120-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuare</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>R-3200-1XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ445 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute 200 proof Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9938&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY PCR Primer&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2482-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Ethidium bromide solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CB-4050-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorMount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Chloride (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>Heat-inactivate before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>676481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Use at dilution: 1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Use at 2ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-165-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

La investigación de la organogénesis en el útero es un proceso técnicamente difícil en los mamíferos placentarios, debido a la inaccesibilidad de los reactivos a los embriones que se desarrollan dentro del útero. Un método de cultivo de gotas recién desarrollado ex vivo en posición vertical ofrece una alternativa atractiva a los estudios realizados en el útero. El cultivo ex vivo gotita proporciona la capacidad de examinar y manipular las interacciones celulares y diversas vías de señalización a través del uso de diversos bloqueo y compuestos activadores; Además, los efectos de diversos reactivos farmacológicos sobre el desarrollo de órganos específicos pueden ser estudiados sin efectos secundarios no deseados de la administración de fármacos sistémico en el útero. En comparación con otros sistemas in vitro, el cultivo de gota no sólo permite la capacidad de estudio de tres dimensiones morfogénesis y las interacciones célula-célula, que no puede ser reproducida en líneas celulares de mamíferos, sino que también requiere significativamente menos reagents que otros ex vivo e in vitro. protocolos Este trabajo demuestra la disección del ratón correcto fetal órgano y técnicas de cultivo de gotita en posición vertical, seguido por inmunofluorescencia órgano completo para demostrar la eficacia del método. El método de cultivo gotita ex vivo permite la formación de la arquitectura de órganos comparable a lo que se observa in vivo y puede ser utilizado para estudiar los procesos de otro modo difíciles de estudio debido a la letalidad embrionaria en modelos in vivo. Como un sistema de solicitud de modelo, un inhibidor de molécula pequeña se utilizará para investigar el papel de la vascularización en la morfogénesis testicular. Este método de cultivo gotita ex vivo es ampliable a otros sistemas de órganos fetales, como el de pulmón y posiblemente otros, aunque cada órgano debe ser ampliamente estudiados para determinar las modificaciones órgano-específicas en el protocolo. Este sistema de cultivo de órganos ofrece flexibilidad en la experimentación con los órganos fetales, y resulta obtained usando esta técnica ayudará a los investigadores a obtener conocimientos sobre el desarrollo fetal.

El cultivo ex vivo de gota le permite a uno para manipular órganos enteros, como el de las gónadas, para estudiar las interacciones celulares y dinámicas. La figura 1 muestra de manera gradual cómo preparar una cultura E11.5 gonadal gotas. Los primeros pasos en el protocolo de cultivo incluyen la eliminación inicial del útero que contiene embrión del ratón madre (Figura 1A y 1B). Después de la extracción del útero de la madre, la pared uterina se corta y los embrione...

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

using-ex-vivo-upright-droplet-cultures-whole-fetal-organs-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K vistas.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Video: Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

El uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Proyección de imagen usando un sistema del ultrasonido de alta frecuencia (30 / 45MHZ) Cardiovascular fetal ratón

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Modelo de herida humana ex vivo y enfoque de tinción de montaje completo para evaluar con precisión la reparación de la piel

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Cultivo de embriones de ratón desde la pregastrulación hasta la organogénesis avanzada

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal skeleton. These morphological changes are initiated and sustained through diverse signaling interactions, which often include protein phosphorylation by kinases. Here, two examples of physiologically-relevant contexts in which to study phosphorylation of proteins during mammalian craniofacial development are provided: mouse facial processes, in particular E11.5 maxillary processes, and cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells derived from E13.5 secondary palatal shelves. To overcome the common barrier of dephosphorylation during protein isolation, adaptations and modifications to standard laboratory methods that allow for isolation of phosphoproteins are discussed. Additionally, best practices are provided for proper analysis and quantification of phosphoproteins following western blotting of whole cell protein lysates. These techniques, particularly in combination with pharmacological inhibitors and/or murine genetic models, can be used to gain greater insight into the dynamics and roles of various phosphoproteins active during craniofacial development.

The protocol presents a method for isolating whole cell protein lysates from dissected mouse embryo facial processes or cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells and performing subsequent western blotting to assess phosphorylated protein levels.

Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...