Instale el equipo de perfusión en la unidad según el protocolo del fabricante. Dentro de una campana, coloque un chip fluídico vacío y agregue medio SFM-34 suplementado con citocinas para llenar ambos depósitos en condiciones estériles. Transfiera la unidad fluídica a la incubadora, conectándola a la bomba para eliminar las burbujas y calibrarla.
Retire con cuidado la unidad fluídica con el conjunto conectado de la incubadora y transfiérala a la campana junto con los chips que contienen las células. Sujete el tubo a ambos lados del chip de prueba. Retire el tubo con abrazadera del chip de prueba y conecte el chip que contiene las celdas al tubo.
Después de quitar o abrir las abrazaderas, transfiera el sistema a la incubadora y conecte la bomba de aire a la unidad de fluídicos. Retire la unidad fluídica de la bomba y muévala a la campana. Sujete el tubo en ambos lados del chip y retire el tubo de los depósitos del chip.
Después de retirar suavemente el medio del chip, lave las células con solución salina tamponada con fosfato o DPBS de Dulbecco. Añadir 150 microlitros de tampón de disociación e incubar durante tres minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células estén separadas, recoja el tampón de disociación de un depósito y lave el canal una vez con DPBS.
Lave el depósito con el tampón de lavado para recoger las células restantes del chip. Finalmente, agregue un mililitro de tampón de lavado a las celdas recolectadas antes de usar 10 microlitros para contar las celdas. Antes de la estimulación, las células mostraban una orientación aleatoria, pero con la estimulación, se reorientaban paralelamente a la dirección del flujo.
El perfil de expresión de CD34 de las células cultivadas bajo flujo durante cinco días y el porcentaje de células positivas para CD34 recuperadas del canal fluídico, mostraron la efectividad del protocolo.
