Neovascularización, la generación de nuevos vasos sanguíneos es un proceso altamente regulado tanto en eventos normales como patológicos. Para entender mejor la neovascularización, es importante reconstruir el proceso en microambiente celular natural in vitro. Hemos desarrollado un chip microfluídico y un control automático.
Las circulaciones altamente eficientes se realizan para formar microtubatos de perfusión y simular el uso de la proteína para recapitular al evento inicial de nueva vascularización. El chip de germinación microfluídica consistió en tres canales. Un canal de cultivo celular endotelial y un canal líquido fueron separados por un amplio canal central de hidrogel.
El sistema de control microfluídico consistía en una bomba de microsyringe y una válvula de pellizco electromagnético. Un chip trampa de burbujas, un chip de brote microfluídico, una bomba micro-peristáltica y un depósito medio de cultivo. Con un sistema microfluídico, las células endoteliales podrían ser estimuladas por un alto estrés de cizalladura luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y varias distribuciones de factores de crecimiento endotelial vascular simultáneamente.
Pipeta 20 microlitros de 125 microgramos por mililitro de fibronectina en un puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular. Corte una punta de pipeta para adaptarse al puerto del canal de cultivo celular con tijeras. Inserte la punta de la pipeta en el otro puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular.
Luego, pipeta fuera del aire del canal de cultivo celular para llenarla de fibronectina. Incuba las virutas a 37 grados centígrados durante una hora. Antes de la siembra celular, pipeta 20 microliter de células endoteliales medio en cada puerto de inyección de medios e incubar los chips a 37 grados Celsius durante 30 minutos.
A continuación, pipetear todos los medios en todos los puertos de inyección de medios. A continuación, pipetear cinco microlitros de suspensión celular en un puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular. Luego, las células endoteliales se extendieron rápidamente por todo el canal bajo presión hidrostática diferencial.
Agregue entre cuatro y seis microlitros de medios ECM al otro puerto para ajustar la presión hidrostática y detener el movimiento de la célula. Control remoto de las virutas a la incubadora de celdas. Luego, gire los chips cada 30 minutos hasta que las células endoteliales se cubran alrededor de la superficie interna del canal de cultivo celular, dos horas más tarde.
Utilice la punta de la pipeta para eliminar las células conectadas en los puertos de inyección con mucho cuidado. A continuación, inserte cuatro adaptadores Luer hembra de púas en los puertos de inyección de medios y rellene con medios ECM. Retire los chips a la incubadora de celdas, cambie los medios ECM y los adaptadores Luer cada 12 horas.
Para ensamblar el sistema de control microfluídico, prepare dos tubos de politetrafluoroetileno, dos tubos cortos de silicona, tres tubos largos de silicona, un adaptador luer hembra de púas, un conector tipo Y y, a continuación, tres conectores tipo L. Llene la jeringa con 10 mililitros de medio ECM precalentado. Conecte un tubo de politetrafluoroetileno a la jeringa mediante un adaptador luer hembra de púas.
A continuación, conecte el otro extremo del tubo de politetrafluoroetileno a un conector de tipo Y. A continuación, conecte dos tubos largos de silicona a los otros dos extremos del conector tipo Y. Utilizamos un tubo para conectarlo al depósito y al otro tubo para conectarlo al chip trampa de burbujas.
Conecte otro tubo largo de silicona al depósito. A continuación, utilice dos tubos cortos de silicona para conectar todos los orificios de entrada y salida en la capa superior del chip trampa de burbujas. Conecte un tubo de politetrafluoroetileno al back-end del chip.
A continuación, fije una jeringa en la bomba de microsyringe. Recorte dos tubos largos de silicona en la válvula de pellizco electromagnético. A continuación, cambie la válvula de pellizco electromagnético para abrir la tubería entre la jeringa y el depósito.
Inyecte los medios en el depósito utilizando una bomba de microsyringe para agotar el aire en el tubo. A continuación, vuelva a cambiar la válvula para abrir la tubería entre la jeringa y el chip trampa de burbujas. Inyecte medios para llenar la cámara líquida y el tubo back-end del chip trampa de burbujas.
Saque las virutas de brote endotelial de la incubadora de células y, a continuación, retire los adaptadores Luer en el lado del cultivo celular. Inserte dos tapones de tubería en los puertos de inyección de hidrogel de chip de brote microfluídico. Conecte el tubo back-end del chip trampa de burbujas a un puerto del canal de referencia celular.
Inserte un conector tipo T en el otro puerto y conéctelo a un tubo de silicio largo conectado con el depósito. Corta el tubo largo de silicona en la bomba micro peristáltica. A continuación, inserte un filtro de aire en el depósito.
A continuación, ensambla el chip microfluídico para la incubadora de la parte superior del escenario. A continuación, conecte la bomba de vacío a los agujeros de la capa inferior del chip trampa de burbujas mediante un tubo TPU. Ajuste el volumen de circulación opuesto y un caudal en el programa personalizado que controla simultáneamente la bomba de microsyringe y la válvula de pellizcar electromagnética.
A continuación, configure el caudal de la bomba micro peristáltica. Encienda la bomba de microsyringe. A continuación, se establece el sistema de control de circulación.
Probamos la función de barrera de algunos micro-recipientes en nuestro modelo midiendo el coeficiente de permeabilidad diffusional de 40 kDa F-I-T-C dextrina. Como se muestra en la figura, el coeficiente de permeabilidad diffusional del chip de cultivo estático con revestimiento celular es de 0,1 más o menos 0,3 micrómetros por segundo. Y el coeficiente de permeabilidad diffusional del canal vacío sin revestimiento celular es de 5,4 más o menos 0,7 micrómetros por segundo.
El ensayo de brotes endoteliales mostró que las células endoteliales brotaron en el hidrogel central en gran parte después de 24 horas de cultivo estático, mientras que el grado de brote disminuyó significativamente con el aumento del estrés de cizallamiento luminal. Cuantitativamente, el estrés de cizallamiento luminal disminuyó significativamente el brote endotelial en términos de área de brotes, longitud media de brotes y la longitud de brote más larga. Con nuestro sistema, el estrés cizallador en las células endoteliales podría cambiarse opcionalmente en cualquier momento durante el experimento, mientras que el flujo transendotelial se mantuvo a nivel fisiológico.
Este modelo biomimético 3D in vitro se puede aplicar directamente al estudio del mecanismo de neovasularización, y mantiene la promesa potencial como una plataforma de bajo costo para aplicaciones de detección de fármacos y toxicología.
