Nuestro protocolo permite una visión única de los mecanismos de nivel de tejido molecular y a granel de la vasculogénesis que pueden ayudar en la vasculatura funcional de ingeniería para la terapia de enfermedades cardiovasculares en el modelado. Este protocolo permite la creación de redes vasculares tridimensionales robustas para evaluar el potencial vasculogénico de varias plataformas, y también proporciona una canalización computacional gratuita y de código abierto para analizar la topología de red final. Comience agregando 250 microlitros de solución de desprendimiento celular por pozo del cultivo celular diferenciado D5D6 durante 10 minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, utilice una punta de pipeta P1000 para disociar las células en suspensiones de una sola célula. A la venta de las soluciones celulares en un solo tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación. Suspendemos el pellet en 200 microlitros de tampón de clasificación de frío helado y etiquetamos las células con cinco microlitros de anticuerpos CD34 conjugados con fluorescencia concentrada durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Al final de la incubación, lave las células en cinco mililitros de tampón de clasificación de frío helado. Filtrar la suspensión a través de un colador de vertido de 40 micrómetros en una clasificación celular activada por fluorescencia de cinco mililitros, o FACS, tubo. Antes de ejecutar la muestra, clasifique una vez 10 de las cuartas células sin etiquetar en el fluocitometro, atando una región a una alta intensidad de fluorescencia que no contenga ninguna de las células sin etiquetar para servir como control negativo.
A continuación, ordene la muestra etiquetada contiene progenitores endoteliales derivados de células madre pluripotentes inducidas basadas en su alta expresión CD34. Al final de la clase, transfiera las células progenitoras endoteliales a un tubo de microcentrífuga para centrifugación. Para la encapsulación de hidrogel de colágeno de las células progenitoras, suspendemos el pellet celular clasificado en 200 microlitros del Medio de Crecimiento Endotelial 2, complementado con 10 micromilitos del Inhibidor ROCK Y-27632.
Agregue las células a 400 microlitros de medio de siembra en un tubo de microcentrífuga de 1,8 mililitros sobre hielo. Mezclar 350 microlitros de colágeno en la suspensión celular. La solución se volverá de color amarillo pálido.
A continuación, mezcle diez microlitros de hidróxido de sodio 1-Muller en la solución de colágeno y células. La solución ahora se convertirá en rosa brillante. Pipetear 56 microlitros de esta solución de células de colágeno neutralizada en pozos individuales de una placa de cultivo celular en U de 96 pozos de unión ultrabaja para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, examine los pozos bajo un microscopio de campo brillante para comprobar que las células se han distribuido uniformemente. A continuación, agregue 100 microlitros de recién preparado Medio de Crecimiento Endotelial 2, complementado con Inhibidor DE ROCK y Factor de Crecimiento Endotelial Vascular a cada pozo y devuelva la placa a la incubadora de 37 grados Celsius. Después de una semana de cultivo, añadir 250 microlitros de 4%paraformaldehído a un pozo de una placa de 48 pozos por hidrogel y eliminar el medio de los hidrogeles.
A continuación, utilice pinzas de punta fina para transferir los hidrogeles al paraformaldehído que contiene los pozos. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lave rápidamente los hidrogeles con PBS y permeabilizar los cultivos 3D con 250 microlitros de un tensioactivo no iónico del 0,5% durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lavar los hidrogeles con dos lavados de cinco minutos a temperatura ambiente con 250 microlitros de PBS, complementados con 300 mililitros de glicina por lavado, seguido de la inmersión de cada hidrogel en 250 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Etiquete las células con los anticuerpos primarios adecuados diluidos en tampón de bloqueo durante la noche a cuatro grados celsius, seguido de dos lavados en un reactivo emulsionante del 0,5% y PBS de Dulbecco. Después del segundo lavado, etiquete las células con el anticuerpo secundario específico de la especie apropiada durante dos horas a temperatura ambiente protegida de la luz, antes de lavar los cultivos 3D dos veces en un reactivo emulsionante del 0,5% y el PBS de Dulbecco, como se ha demostrado. Para visualizar los núcleos celulares, añada DAPI, diluido a una concentración de uno a 10000 en PBS a las muestras para una incubación de dos minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en un 0,5% de reactivo emulsionante y PBS de Dulbecco.
A continuación, utilice pinzas de punta fina para transferir cada muestra a un recipiente de visión adecuado. Después de la diferenciación, clasificación y encapsulación en hidrogeles de colágeno, las células normalmente permanecerán redondeadas durante 24 horas, antes de comenzar a migrar y formar lúmenes iniciales. Después de unos seis días de cultivo, un plexo capilar primitivo será visible en el hidrogel cuando se ve con microscopía de campo brillante.
Después de tomar imágenes de los hidrogeles fijos, manchados y cargados de células en un microscopio confocal, las imágenes preprocesadas se convierten en un esqueleto que permite un análisis de la longitud total y la conectividad de la red. Es imperativo añadir antibióticos después de FACS, ya que esterilizar el interior de este instrumento es difícil, y eliminar los antibióticos 24 horas después de la encapsulación celular. Usando esta técnica, pudimos determinar qué características físicas y químicas la matriz extracelular imitando los biomateriales gobiernan el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC.
