Comience incubando las fibras del músculo esquelético de la rata con TMRE a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, inicie el software estándar del microscopio confocal y elija el marco de configuración. En el cuadro de diálogo Configuración de hardware, seleccione Láser y marque la opción Helium Neon 543.
Acceda al cuadro de diálogo de adquisición a través del marco Adquirir y seleccione el panel XYZ. A continuación, selecciona el formato 512x512 con una velocidad de 400 hercios. En el panel estenopeico que se muestra, seleccione unidades arbitrarias e introduzca tres áreas para el estenopeico.
En el cuadro de diálogo Configuración de la ruta del grano, seleccione un objetivo de inmersión en agua de 20 x con una apertura numérica de 0,7 y una ventana de longitud de onda de emisión de 576 a 700 nanómetros. Elija DD 488543 y configure la potencia del láser para el láser 543 en 15%Después de una incubación de 20 minutos, cambie el medio de incubación dos veces. A continuación, prepare la cámara de grabación con una cubierta de vidrio de silicato boro de 0,15 milímetros.
Transfiera los haces de fibra a la cámara que contiene 200 microlitros de solución relajada. Utilice el modo de campo claro del microscopio confocal para identificar fibras viables para el registro fluorescente de las mitocondrias. Ajuste, gane y compense escaneando la fluorescencia con el botón Live.
Elija valores bajos de intensidad fluorescente para un fondo de casi cero unidades arbitrarias y una señal mitocondrial entre 100 y 200 unidades arbitrarias. Seleccione un tamaño de píxel entre 150 y 190 nanómetros y ajuste el factor de zoom en el cuadro de diálogo XY para adquirir el ancho completo de la fibra. En el cuadro de diálogo Pila Z, establezca la distancia Z a partir de una profundidad de fibra de 15 micrómetros hasta 22 micrómetros y elija un tamaño de paso Z de 3 micrómetros.
Haga clic en el botón Inicio para adquirir las imágenes confocales y obtener una pila Z compuesta por tres imágenes confocales adquiridas a 15, 18 y 21 micrómetros de profundidad. Las imágenes confocales de una fibra muscular de envoltura magra ejercitada muestran un registro esperado de mitocondrias de fibra muscular esquelética con un patrón de fibra consistente. Por el contrario, la fibra muscular de la rata obesa muestra alteraciones sustanciales en el contenido y distribución mitocondrial.
