Comience iniciando el software de análisis de imágenes. A continuación, abra el archivo Z-stack y ajuste la orientación para colocar la fibra horizontalmente. Elija una región rectangular de interés o ROI que cubra el área mitocondrial.
Seleccione tamaños que van de 65 a 90 micrómetros en la dirección X y tamaños apropiados en la dirección Y según el ancho de la fibra. Proceda a duplicar la pila Z con el ROI seleccionado. Y guárdalo como una nueva pila Z en formato Tiff.
Guarde la posición del ROI de la pila original con la herramienta Administrador de ROI. Abra el cuadro de diálogo del umbral con el acceso directo, Comando+Mayús+T. Elija el algoritmo de umbral Otsu y seleccione la opción de fondo oscuro en blanco y negro.
Observe el histograma de la distribución de la intensidad de fluorescencia y el valor umbral que se muestra en el cuadro de diálogo. Aplique el umbral a la pila de imágenes binarias y, a continuación, elija Calcular umbral para cada imagen y cree una nueva pila en el cuadro de diálogo que se muestra antes de hacer clic en Aceptar. Guarde la pila generada con tres imágenes binarias en formato Tiff. A continuación, acceda al menú Analizar y seleccione Histograma.
En el cuadro de diálogo Histograma que se muestra, haga clic en Sí. Y en el cuadro de diálogo Histograma de la pila, haga clic en Lista para obtener los datos del histograma. Transfiera los datos del histograma a una hoja de cálculo e identifique los mitopíxeles con un valor de 255.
Calcula la densidad mitocondrial dividiendo los mitopíxeles por el total de píxeles y multiplicando por 100. La fibra de rata obesa presentó una menor densidad mitocondrial. Esto fue confirmado por el análisis de la imagen de la pila.
