Para comenzar, tome las muestras fecales humanas preparadas. Enfríe la centrífuga refrigerada de alta velocidad a 4 grados centígrados. Utilice PBS para ajustar el peso de los tubos de muestra a 0,1 gramos y centrifugarlos a 3.000 g durante 20 minutos a 4 grados centígrados.
Con una pipeta de plástico, transfiera el sobrenadante a dos tubos de 50 mililitros, dejando 1 mililitro. A continuación, centrifugar el sobrenadante a 12.000 G durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Con una jeringa de 20 mililitros, aspire el sobrenadante y retire la aguja de la jeringa.
Filtra el líquido a través de filtros de 0,22 micrómetros en tubos de 50 mililitros. A continuación, limpie el cubo con alcohol al 75% para eliminar cualquier resto de contaminación. Transfiera aproximadamente 30 mililitros del sobrenadante fecal filtrado al tubo de ultracentrífuga.
Llene el tubo con aproximadamente 8 mililitros de PBS, dejando un espacio de 3 milímetros desde la abertura del tubo. Coloque los dos tubos de ultracentrífuga en cubos de ultracentrifugación opuestos e iguale el peso de los dos cubos utilizando PBS. Cargue todos los cucharones en el rotor, independientemente de si están cargados con tubos.
Coloque las muestras en la centrífuga, inicie el vacío y gírelas a 160, 000 G durante 70 minutos a 4 grados centígrados. Tan pronto como se complete la centrifugación, libere el vacío de la cámara y abra la puerta de la ultracentrífuga. Luego, retire rápidamente el rotor.
Transfiera los cubos del rotor a la rejilla y recoja los tubos con una pinza. Deseche el sobrenadante y guarde los gránulos marrones visibles. Agregue 1 mililitro de PBS preenfriado para resuspender los gránulos por completo.
Llene el tubo con aproximadamente 37 mililitros de PBS, dejando un espacio de 3 milímetros desde la abertura. Después de realizar otra ronda de ultracentrifugación, deseche el sobrenadante y deje el tubo invertido durante 5 minutos. Retire cualquier resto de solución en la pared interior con limpiaparabrisas.
Con una pipeta de 1.000 microlitros, agregue 1,2 mililitros de PBS preenfriado para resuspender los gránulos y mézclelos mediante pipeteo. Transfiera 1,2 mililitros de la solución PBS BEV de un tubo de ultracentrífuga a un microtubo limpio de 1,5 mililitros.
