Este protocolo es importante porque proporciona una forma de aislar vesículas extracelulares de una variedad de bacterias de una manera altamente reproducible. Lo mejor de esta técnica es que se puede utilizar para aislar EV de entornos bastante grandes de cultivos bacterianos, lo que permitirá estudios in vivo. Si bien los datos que mostramos reflejan aplicaciones preclínicas, es previsible que este protocolo pueda adaptarse a la fabricación de EV bacterianas para terapia.
Este método se puede aplicar a cualquier sistema de cultivo celular escalable con modificaciones menores. Debido a la escalabilidad del protocolo, es importante tener filtros y columnas SEC de tamaño adecuado para manejar los volúmenes iniciales deseados de cultivo celular bacteriano. Demostrando los procedimientos están Sadie Johnson, tecnóloga asistente en el laboratorio del Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, becario de oncología en el laboratorio del Dr. Justin Lathia, y Akeem Santos, un tecnólogo de investigación en mi laboratorio.
Comience por inocular colonias individuales de Escherichia coli en 250 a 1000 mililitros de Luria-Bertani, o caldo LB, utilizando un bucle estéril. Luego, incubar el cultivo aeróbicamente en una incubadora de agitación a 300 rotaciones por minuto y 37 grados centígrados. Después de 48 horas de incubación, aclarar el medio de cultivo bacteriano transfiriendo los cultivos celulares para limpiar botellas de centrífuga de polipropileno de 500 mililitros para centrifugar en un rotor de ángulo fijo de gran capacidad a cuatro grados Celsius y 5, 000 veces G durante 15 minutos.
Transfiera el sobrenadante a las botellas de centrífuga limpias vertiendo cuidadosamente a la centrífuga a 10, 000 veces G durante 15 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un dispositivo de filtro accionado por vacío de polietersulfona de 0,2 micras de un tamaño adecuado y conecte el dispositivo de filtración a un suministro de pared de vacío. Si la tasa de filtración disminuye significativamente, mueva el material sin filtrar a un nuevo dispositivo.
El medio filtrado se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante la noche o se puede procesar de inmediato. Para comprobar la eliminación completa de las células viables, esparcir una alícuota del sobrenadante filtrado en placas de agar adecuadas y garantizar la ausencia de colonias después de la incubación en condiciones óptimas para la cepa bacteriana. Para concentrar el medio filtrado con un volumen de 100 mililitros, cargue 90 mililitros de medio de cultivo filtrado en el depósito del dispositivo de ultrafiltración centrífuga con un corte de peso molecular de 100 kilodaltons y centrifugue el medio en rotor de cangilón oscilante a cuatro grados Celsius y 2, 000 veces G durante intervalos de 15 a 30 minutos hasta que el volumen del depósito superior se haya concentrado a menos de 0.5 mililitros.
Para rellenar el depósito con cualquier medio de cultivo filtrado restante, retire el flujo en la parte inferior del dispositivo para reequilibrarlo. Si la viscosidad del medio concentrado en el depósito aumenta visiblemente, diluya el medio con PBS y vuelva a concentrar por centrifugación para reducir cualquier vesícula no extracelular, o proteínas EV, más pequeñas que el límite de peso molecular de 100 kilodaltons. Luego, transfiera el medio concentrado a un tubo de unión de baja proteína para almacenar a cuatro grados centígrados durante la noche Para concentrar el medio filtrado con un volumen superior a 100 mililitros, seleccione un dispositivo de filtración de flujo tangencial del tamaño adecuado, o TFF, con un límite de peso molecular de 100 kilodaltons.
Después de ensamblar un circuito de filtración como se explica en el manuscrito, bombee 200 mililitros de PBS en un recipiente graduado para determinar la velocidad apropiada correspondiente al caudal deseado. Cuando se ajuste la velocidad, hacer circular el medio acondicionado filtrado a aproximadamente 200 mililitros por minuto a temperatura ambiente y recoger las moléculas menores de 100 kilodaltons, cruzando la membrana de ultrafiltración como residuo en un recipiente separado hasta que el volumen del medio acondicionado se haya reducido a 100 a 200 mililitros. Diluya secuencialmente el volumen filtrado dos veces con PBS y continúe circulando el medio con la bomba en recipientes más pequeños para concentrar el volumen a 75 a 100 mililitros, y luego a 25 mililitros y 10 mililitros.
Levante el tubo de alimentación del depósito de muestras y bombee para purgar el filtro y recuperar la cantidad máxima de la muestra. Mueva la muestra concentrada a un dispositivo de ultrafiltración centrífuga de 15 mililitros con un límite de peso molecular de 100 kilodaltons y centrifugar en un rotor de cangilón oscilante a cuatro grados Celsius y 2, 000 veces G durante intervalos de 15 a 30 minutos hasta que el volumen del medio en el depósito superior sea inferior a dos mililitros. Transfiera el medio concentrado a un tubo de unión bajo en proteínas para almacenarlo a cuatro grados centígrados durante la noche.
Para el aislamiento de los EV, realice cromatografía de exclusión de tamaño, o SEC, utilizando una columna pequeña con un volumen de lecho de 10 mililitros para menos de 100 mililitros de material de partida y una columna más grande con un volumen de lecho de 47 mililitros para más de 100 mililitros de material de partida. Durante varias horas antes del experimento, lleve la columna SEC y el PBS a temperatura ambiente, seguido de estabilizar la columna en posición vertical utilizando un soporte y soporte de laboratorio estándar. Antes de conectarse a la columna SEC, hidrate el depósito de muestra permitiendo que cinco mililitros de PBS fluyan a través de la frita hacia un contenedor de desechos.
Luego, desenrosque la tapa de entrada de la columna para agregar dos mililitros de PBS al depósito de muestra y conecte cuidadosamente el depósito a la columna a medida que el PBS gotea a través de la frita. Para equilibrar la columna, agregue 47 mililitros de PBS al depósito de muestra, seguido de destapar la parte inferior de la columna SEC. A continuación, permita que todo el búfer de muestra cargado fluya a través de la columna y deseche el flujo.
Después de cargar dos mililitros de la muestra en el depósito de muestra, permita que la muestra ingrese completamente a la columna y recoja el flujo. Agregue inmediatamente PBS al depósito de muestra a un volumen de 14.25 mililitros menos el volumen de muestra para permitir que la solución fluya a través de la columna, mientras descarta la cantidad igual al volumen vacío de la columna. A continuación, coloque un microtubo de baja unión de dos mililitros directamente debajo de la columna SEC para recoger el primer flujo o fracción uno después de permitir que dos mililitros de PBS pasen a través de la columna.
Continúe agregando dos mililitros de PBS al depósito de muestra para recolectar cada fracción subsiguiente. Almacene las fracciones recolectadas a cuatro grados centígrados para el almacenamiento a corto plazo o menos 80 grados centígrados para el almacenamiento a largo plazo. Para la prueba de esterilidad de las fracciones recolectadas de EV, inocular tres mililitros del medio de cultivo con 100 microlitros de las fracciones que se utilizarán en los ensayos.
Luego, cultive el medio en condiciones óptimas mientras observa la turbidez durante al menos tres días. Alternativamente, las muestras de fracción se pueden aplicar a placas de agar que contienen el medio utilizado para cultivar las bacterias productoras, luego verificar la formación de colonias. A continuación, almacene los EV transfiriendo del 25 al 50% de las fracciones individuales o agrupadas a tubos de unión de baja proteína a menos 80 grados centígrados para evitar ciclos de congelación y descongelación.
El análisis representativo muestra la elución de Escherichia coli MP1 EVs en las fracciones cromatográficas tempranas. Las fracciones uno a seis contenían la mayor cantidad de EV, con un diámetro promedio inferior a 100 nanómetros. Al mismo tiempo, las fracciones posteriores contenían proteínas libres de EV y muy pocas EV.
El enriquecimiento y el tamaño de EV se confirmaron mediante microscopía electrónica de transmisión, particularmente en las fracciones dos a seis. Se observó que las fracciones enriquecidas con EV dos a siete tenían una alta actividad de nanoluciferasa, pero solo una señal fluorescente muy baja de mCherry no asociada a EV en comparación con la de las fracciones posteriores. El etiquetado de inmunooro confirmó la asociación EV de la nanoluciferasa en las fracciones dos a cinco.
La aplicabilidad del protocolo a las otras especies bacterianas se evaluó mediante el aislamiento de EV de los cultivos de diversas bacterias anaeróbicas. Se observó que las primeras fracciones cromatográficas uno a cuatro estaban enriquecidas para EVs, con un diámetro inferior a 100 nanómetros. La compleja infusión cerebro-corazón, o BHI, contenía las partículas del tamaño de EV a menos del 25% del rendimiento total de EV.
Es importante utilizar dispositivos TFF capaces de manejar el volumen inicial del cultivo celular bacteriano. Esta técnica nos permite generar suficientes EVs para hacer preguntas biológicas sobre su función en modelos animales complejos.
