Comience pipeteando 0,5 mililitros de un cultivo de chlorella vulgaris en fase logarítmica. Extienda el cultivo en la placa de Tris-Acetato-Fosfato o Agar TAP. Cultive el cultivo durante cinco días a 25 grados centígrados.
A continuación, inocule 10 mililitros de caldo LB suplementado con un asa llena de cultivo electroporado de agrobacterium tumefaciens en un matraz agitador. Incubar el matraz a 28 a 30 grados centígrados y 250 RPM durante la noche. Al día siguiente, inocule un mililitro del cultivo durante la noche en 50 mililitros de LB suplementado. Incubar el matraz a 28 a 30 grados centígrados y 250 RPM.
Co-cultivar los cultivos de algas y bacterias. Primero, transfiera el cultivo de agrobacterias a un tubo de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 4.000 G durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, pipetear el sobrenadante para desecharlo y lavar las células dos veces con el medio de inducción. A continuación, agregue 25 mililitros de medios de inducción en la placa de cultivo de Chlorella Vulgaris. Transfiera las células a un tubo de 50 mililitros, luego centrifugue a 4, 000 G durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, combine el gránulo de células de algas con 200 microlitros de la suspensión bacteriana. Agite el cultivo combinado en una incubadora rotativa a 21 a 25 grados centígrados, dicho a 150 RPM durante una hora. Esparcir 200 microlitros del cultivo mixto en placas de medio de inducción, suplementadas con 15 milimoles de glucosa e incubar las placas en la oscuridad a 21 a 25 grados centígrados durante tres días.
Después de tres días, recoja las microalgas en un matraz con 10 mililitros de medios TAP. Suplementado con 20 miligramos por litro de tetraciclina. Incubar el matraz en la oscuridad durante dos días, manteniendo una temperatura entre 21 y 25 grados centígrados.
Colocar 500 microlitros del cultivo en un medio selectivo suplementado con 20 miligramos por litro de tetraciclina. Incube las placas a una temperatura de 21 a 25 grados centígrados en la oscuridad durante dos días, antes de trasladarlas a una cámara iluminada. Seleccione colonias individuales de la placa de transformación y escríbalas en placas de agar TAP.
Para realizar la PCR de colonias, comience agregando un pequeño volumen de células de algas transformantes a 10 microlitros de agua estéril. Hervir la solución a 98 grados centígrados durante 15 minutos. Del mismo modo, procese otra plantilla de PCR para la confirmación de la ausencia de agrobacterias en la muestra.
Pasar las muestras de PCR en un gel de agarosa de ADN con una escalera, para verificar el tamaño de los fragmentos resultantes. Las colonias transformadas pudieron crecer en placas que contenían higromicina con cefotaxima. Las colonias de tipo silvestre no crecieron en las placas.
Se obtuvieron colonias resistentes hasta 70 miligramos por litro de cefotaxima. El amplicón de PCR de colonia de pCAMBIA1302 estuvo ausente en las muestras de algas. Sin embargo, se detectó MGFP5G en amplicón en las tres muestras de algas.
Los cultivos de algas que fueron repetidamente subcultivos de cefotaxima mostraron la ausencia de la proteína de virulencia E2, indicativa de ausencia de plásmidos. Se observó una diferencia significativa en el crecimiento algal de las cepas transformantes y de tipo silvestre. A pesar de un menor crecimiento, el transformante tuvo niveles de fluorescencia más altos cuando se normalizó la densidad celular.
