Para preparar los pocillos de cultivo, marque la tapa de una placa de 24 pocillos con el código de donante A o B, la fecha y la dosis. Retire los viales criogénicos que contienen sangre humana del nitrógeno líquido y descongélelos parcialmente en el baño de agua tibia hasta que se vean pequeños cristales de hielo. A continuación, en una campana de flujo laminar, abra con cuidado el vial para evitar que se derramen burbujas de aire dentro del tubo.
Vuelva a suspender y transfiera el contenido del vial a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Mientras gira suavemente el tubo, gota a gota, agregue un mililitro de PBS precalentado. Utilice una pipeta P-1000 para mezclar PBS y sangre.
Para una dilución y un lavado uniforme, agregue siete mililitros de PBS precalentado al tubo de 15 mililitros y mezcle por pipeteo. Centrifugar la sangre a 180 g durante ocho minutos. Mientras tanto, llene los pocillos sin etiquetar de una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de PBS y precaliente la placa a 37 grados centígrados.
Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro en el tubo sin alterar la paleta. Con una pipeta, vuelva a suspender la paleta en el sobrenadante restante. A continuación, añada gradualmente ocho mililitros de PBS tibio en el tubo como se ha demostrado anteriormente.
Centrifugar la sangre resuspendida. Mientras tanto, agregue 200 microlitros de medio de cultivo RPMI a los pocillos marcados y precaliente la placa como se demuestra. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, dejando aproximadamente 80 microlitros del sobrenadante.
A continuación, añade 280 microlitros de suero fetal para terneros y vuelve a suspender la paleta. Transfiera 180 microlitros de la suspensión celular a los pocillos marcados. Incubar la placa en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
