Después de cultivar una muestra de sangre criopreservada descongelada, irradiarla con las dosis de rayos X requeridas a temperatura ambiente. A continuación, agregue 1,62 mililitros de medio de cultivo RPMI tibio a cada pocillo. Para estimular la división celular en linfocitos T, agregue 40 microlitros de fitohemaglutinina a cada pocillo y vuelva a suspender completamente.
Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 23 horas. Al día siguiente, agregue ocho microlitros de citocalasina B por pocillo para bloquear la citocinesis. Después de 70 horas, retire la placa de la incubadora y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.
Enjuague cada pocillo con dos mililitros de PBS y agregue este PBS al tubo de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 180 G durante ocho minutos y desechar el sobrenadante, dejando 500 microlitros sobre el pellet. Mientras agita el gránulo en vórtice, agregue dos mililitros de cloruro de potasio frío en el tubo.
Nuevamente, centrifugue y deseche el sobrenadante como se demostró anteriormente. Agite el gránulo agregando lentamente dos mililitros de fijador frío 1 e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar y desechar el sobrenadante.
Mientras se vórtice el gránulo en forma de gota, agregue dos mililitros de fijador frío 2 al tubo. Deje el tubo durante la noche a cuatro grados centígrados. Centrifugar la muestra y transferir el sobrenadante a otro tubo para concentrar las células de acuerdo con el tamaño del gránulo.
Limpie los portaobjetos con isopropanol y etiquételos correctamente. Después de vórtice el gránulo, agregue 40 microlitros de suspensión de celda fija en un portaobjetos. Después del secado, sumerja el portaobjetos en tinte naranja de acridina durante un minuto.
Luego, lave el portaobjetos rápidamente con agua destilada antes de colocarlo en un tampón de fosfato durante un minuto. Seca la parte posterior del portaobjetos y colócalo sobre papel de seda limpio. Agregue 20 microlitros de tampón de fosfato en el portaobjetos y cúbralo con un cubreobjetos limpio, evitando burbujas de aire.
Selle el portaobjetos con cemento de silicona. Coloque el portaobjetos bajo un microscopio fluorescente y examine las células binucleadas. Por último, cuente manualmente los micronúcleos.
La presencia de células binucleadas redondeadas indicó la recuperación exitosa de células viables sanas a partir de muestras de sangre entera criopreservadas. Con el aumento de las dosis de radiación, se observó un aumento cuadrático lineal en el rendimiento de micronúcleos. Los rendimientos de micronúcleos de fondo en las muestras de control irradiadas simuladamente se debieron principalmente a cromosomas rezagados.
