Para comenzar, precaliente una cantidad adecuada de medios de cultivo estériles mientras está a punto de completarse el pretratamiento de 48 horas con dexametasona del explante de extremidades posteriores murinas. Una vez finalizado el pretratamiento, traslade los explantes pretratados a la cabina de bioseguridad. Para el grupo descargado, aspire los medios de pretratamiento y transfiera los explantes a placas de Petri frescas.
Agregue 70 mililitros de medios de cultivo a cada plato antes de devolverlos a la incubadora. Para preparar las plataformas de explante para el grupo de tensión de referencia y impacto estático, corte trozos de papel de lija para que coincidan con el tamaño de las placas de agarre. Para el grupo de impacto estático, corte trozos de línea trenzada y haga un nudo suelto a la mitad a lo largo de la línea.
Rasga pedazos de papel de aluminio para cubrir cada baño acrílico y rocíalos con etanol al 70%. Transfiera los componentes preparados a la cabina de bioseguridad. Organice los componentes como el baño acrílico, la base, las inserciones de reducción de volumen, el clip y las empuñaduras para el montaje de la plataforma.
Coloque los componentes de la plataforma dentro de contenedores secundarios de volumen suficiente para contener cualquier posible fuga de medios de cultivo. Sumerja los recipientes en una solución de al menos un 10% de lejía durante un mínimo de una hora. Enjuaga las soluciones de lejía con agua del grifo.
Después de transferir los componentes enjuagados al gabinete de bioseguridad, use tornillos M3 y resortes de compresión para fijar las platinas a las empuñaduras. Fije firmemente las empuñaduras a la base con un tornillo M5 e inserte los tornillos M6 hasta que entren en contacto con las placas. Mejore la funcionalidad de las platinas colocando papel de lija con cinta adhesiva de doble cara.
Cierre las empuñaduras para facilitar la adherencia de la lija a los platos. Para cargar una plataforma, abra completamente las empuñaduras y use pinzas para colocar con cuidado la parte superior de la pierna y la rodilla entre las platinas. Cierre las empuñaduras suavemente para mantener la extremidad en su lugar.
Use fórceps para agarrar la cabeza o el pie femoral expuesto y ajuste el ángulo de flexión de la rodilla, mientras cierra gradualmente los fórceps para asegurarlos en su lugar. Para el grupo de tensión basal, extienda la articulación de la rodilla mientras cierra las empuñaduras. En el caso del grupo de pinzamiento estático, flexionar la articulación de la rodilla mientras se cierran las empuñaduras.
Para el grupo de impacto estático, coloque el nudo simple de la cuerda alrededor de la pata distal y apriételo firmemente. Pasa la cuerda a través de una ranura en la base debajo del explante y a través del orificio del clip. Coloque la base en la bañera acrílica y fije el clip al borde superior de la bañera.
Para dorsiflexionar el pie, tire de la cuerda hasta que alcance al menos 110 grados en relación con la tibia. Utilice un marcador permanente para marcar la cuerda a medida que sale del clip. Tome una fotografía del explante en esta posición dorsiflexionada para cuantificar en el futuro el ángulo de dorsiflexión.
Retire la base de la configuración y coloque el inserto de reducción de volumen deslizándolo a lo largo de un riel en la base. Vuelva a colocar la base en el baño acrílico y vuelva a colocar el clip en el borde superior. Utilice la cadena marcada como guía.
Tire de él para restaurar el pie a su ángulo de dorsiflexión original y asegure la cuerda al exterior de la bañera con cinta adhesiva para mantener una posición estática de flexión dorsal. Para el grupo de tensión basal, una vez que el explante esté colocado entre las mordazas, tome una fotografía para cuantificar el ángulo de dorsiflexión. A continuación, deslice el inserto de reducción de volumen sobre la base y colóquelo en el baño acrílico.
Agregue 125 mililitros de medios de cultivo precalentados a cada plataforma para sumergir los explantes. Después de cubrir la parte superior del baño con papel de aluminio, coloque toda la configuración en un recipiente secundario. Vuelva a colocar el recipiente secundario en la incubadora y el cultivo durante siete días.
