Para comenzar la recolección de médula ósea, remoje una rata sacrificada en etanol al 75% para esterilizar el pelaje y la piel. Coloca a la rata boca arriba y corta las extremidades inferiores a la altura de la cadera para proteger la cabeza del fémur. Use tijeras de disección para cortar el ligamento en la articulación del corvejón.
A continuación, dobla la articulación de la rodilla hacia atrás para exponer el fémur y la tibia. Con un par de pinzas y tijeras, retire con cuidado los músculos, tendones y otros tejidos conectados a los huesos. Introduzca la médula a través de ambos extremos óseos con una jeringa agujereada de 5 milímetros para aflojar la matriz de la médula.
Ahora use una jeringa nueva para enjuagar la médula ósea con 10-15 mililitros de medio RPMI. Centrifugar las células de la médula ósea a 300 g durante 10 minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 5-10 mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos.
Después de incubar la suspensión, agregue cuatro veces el volumen de HBSS a la mezcla. A continuación, centrifugar las células a 600 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Utilice el gránulo resultante para su uso posterior.
Aísle primero los neutrófilos con el kit de aislamiento de neutrófilos de médula ósea de rata. Coloque una capa de 2 mililitros de 80-55% por reactivo en un tubo de centrífuga de 15 mililitros, para crear un gradiente de densidad. A continuación, pipetee los neutrófilos aislados, o la solución de resuspensión de las células aisladas con el kit de aislamiento de neutrófilos de médula ósea de rata, en el tubo.
Centrifugar el tubo a 800 G durante 40 minutos a 20 grados centígrados. Con una pipeta estéril, recoja la capa de gradiente del 70 %, incluidas las capas celulares en el límite del 65-70 %. Transfiera la suspensión de la celda a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Agregue 15 mililitros de HBSS en el tubo e invierta suavemente para mezclar su contenido. Finalmente, centrifugar el tubo a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente para granular las células. Para el proceso de un solo paso, después de pipetear la suspensión de médula ósea directamente en el tubo de gradiente de densidad, centrifugar como se demostró anteriormente.
A continuación, pipetee la capa 70%gradient, incluidas las capas en el límite 75-70%gradiente. Transfiera esta suspensión de celda a un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros con 10 mililitros de HBSS. A continuación, centrifugar el tubo a 400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente para granular las células.
Cuente los neutrófilos aislados con un hemocitómetro y evalúe la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano. El método de dos pasos tuvo un nivel de pureza mejorado del 90% en relación con el 50% logrado por el método de un solo paso.
