Adquisición y verificación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) de rata

Para comenzar, resuspenda los neutrófilos aislados de rata en cuatro mililitros de medio RPMI suplementado en una placa de Petri estéril de 10 centímetros. A continuación, agregue cuatro microlitros de PMA a la suspensión de neutrófilos para desencadenar la formación de NET. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante tres horas bajo un 5% de dióxido de carbono.

Para el control negativo, agregue de cuatro a cinco microlitros de DNASA1 a la suspensión de neutrófilos para degradar los NET secretados. Luego, agregue cuatro mililitros de HBSS para lavar los NET. Enjuague la placa con cuatro mililitros de medios de cultivo frescos para cada placa para separar las redes electrónicas.

Ahora, recoja el medio de lavado en un tubo nuevo y pipetee con frecuencia para garantizar la resuspensión completa de los NET. Centrifugar la suspensión a 300 g durante 10 minutos a 20 grados centígrados para eliminar las células flotantes. Luego, recoja el medio sobrenadante con NET en un tubo nuevo.

Centrifugar la suspensión de los NET y las celdas flotantes en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 1,4 centímetros colocados en ella para asentar las celdas flotantes. A continuación, fije las celdas en las hojas de cubierta con 4% de PFA y proceda a verificar la presencia de los NET. A continuación, coloque una gota de HBSS en un soporte de tubo de ensayo cubierto con una película de parafina.

Invierta el cubreobjetos en las gotas de HBSS para lavarlo. Después del lavado, incubar las células en 250 microlitros de Triton X-100 0,5x durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizarlas. Luego, lave las células tres veces en HBSS durante un minuto.

Selle las células en suero de burro normal al 10% a temperatura ambiente durante una hora. Finalmente, incubar las células con 70 a 90 microlitros de anticuerpos anti-ratas durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave la funda en HBSS tres veces durante cinco minutos cada una.

Ahora, incube el cubreobjetos en los anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad antes de lavar un HBSS. Tiñir los núcleos celulares y los esqueletos de los NET en 70 a 90 microlitros de DAPI. Realice el lavado HBSS tres veces durante cinco minutos cada una.