Cuantificación fluorométrica y análisis citométrico de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) de rata

Para empezar, pipetear 50 microlitros de las muestras aisladas de NET de rata en un tubo con 450 microlitros de tampón Tris-EDTA. Ahora pipetea 100 microlitros de los patrones de ADN y las muestras en una placa de 96 pocillos. Agregue un volumen igual de reactivo de ensayo en los pocillos.

A continuación, incube la placa a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos, evitando la exposición a la luz directa. Coloque la placa en un lector de microplacas de fluorescencia. Establezca un espectro de emisión de alrededor de 530 nanómetros y un espectro absorbente de aproximadamente 480 nanómetros.

Incubar las células en un microlitro de una tinción de núcleo durante 30 minutos. A continuación, incuba las células en un microlitro de cepa de ADN libre de células durante 10 minutos. Mezcla suavemente los tintes fluorescentes.

Cargue la placa de muestra en el citómetro. Cambie al canal SYTOX Green y, a continuación, seleccione el canal HEXT. Establezca la iluminación en Azul 377/447 y ajuste el tiempo de exposición a 300, 000 microsegundos.

Haga clic en Configuración enfocada y luego haga clic en Registrar automático para ajustar automáticamente el enfoque. Seleccione el canal verde SYTOX y ajuste la iluminación a verde 483/536. Ajuste el tiempo de exposición de SYTOX Green a 30.000 microsegundos.

Haga clic en Iniciar escaneo para comenzar el proceso de escaneo. Se observaron respuestas comparables en la secreción de NET entre los neutrófilos periféricos y de la médula ósea, independientemente de la estimulación de PMA. Las Rat NET también exhibieron capacidades limitadas de reticulación entre sí.

La incubación con PMA condujo a un aumento del 10% en el contenido de ADN libre de células después de cuatro horas, lo que indica una mayor propensión a desencadenar la formación de NET.