Extraction and Analysis of DNA from the Cellular Component of the Eye Humor

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January 12th, 2024

DOI :

10.3791/200816-v

January 12th, 2024

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Noah A. Brown¹, Rajesh C. Rao¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸, Bryan L. Betz¹

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Center of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Center for RNA Biomedicine, University of Michigan, Ann Arbor, ⁷A. Alfred Taubman Medical Research Institute, University of Michigan, Ann Arbor, ⁸Section of Ophthalmology, Surgery Service, Veterans Administration Ann Arbor Healthcare System

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Para realizar la extracción de ADN, primero agregue una cantidad adecuada de solución de lisis celular al gránulo celular obtenido del humor ocular. Pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclarla bien. Una vez que las células estén completamente lisadas, agregue una solución de precipitado de proteína para constituir un tercio del volumen total.

Ahora, haga vórtice y mezcle vigorosamente durante 20 a 30 segundos. Luego gíralo durante tres minutos a 3000 g a temperatura ambiente. Mientras tanto, transfiera 300 microlitros de isopropanol a un tubo de microcentrífuga limpio.

Una vez completada la centrifugación, pipetee cuidadosamente el sobrenadante en el tubo que contiene isopropanol. A continuación, agregue 1,5 microlitros de glucógeno al tubo e invierta el tubo para mezclar bien. Coloque el tubo a -20 grados centígrados en un congelador durante una hora o toda la noche para facilitar la precipitación del ADN.

Después de congelar, centrifugar el tubo a los cinco minutos a 3000 g a temperatura ambiente. A continuación, pipetea el isopropanol. Para lavar el pellet, agregue 0,5 mililitros de etanol al 70%.

Invierta el tubo suavemente para asegurar un lavado uniforme. A continuación, gire el tubo durante un minuto a 3000 g a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante del tubo de la centrífuga.

Ahora, invierta el tubo sobre una gasa limpia para drenar la solución y secar el gránulo. Después de un centrifugado rápido en la microcentrífuga, utilice una punta de pipeta desechable de punta fina para pipetear la gota de etanol restante. A continuación, agregue 45 microlitros de solución de hidratación de ADN al gránulo de ADN seco.

Luego coloque el tubo en un bloque calefactor ajustado a 50 grados centígrados. Los rendimientos de ADN de los componentes celulares y libres de células de los fluidos oculares fueron similares. Se realizó un análisis por PCR de los componentes celulares y celulares libres de una mutación asociada al linfoma vitreorretiniano.

Se presentó una mayor tasa de mutación en el componente libre de células, como lo demuestra un umbral de ciclo más bajo.

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