Cell-Free DNA Extraction and Analysis from Eye Humor

Tenga en cuenta que todas las traducciones están generadas por IA. Haga clic aquí para ver la versión en inglés.

126 Views

•

02:00 min

•

January 12th, 2024

DOI :

10.3791/200817-v

January 12th, 2024

•

Noah A. Brown¹, Rajesh C. Rao¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸, Bryan L. Betz¹

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Center of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Center for RNA Biomedicine, University of Michigan, Ann Arbor, ⁷A. Alfred Taubman Medical Research Institute, University of Michigan, Ann Arbor, ⁸Section of Ophthalmology, Surgery Service, Veterans Administration Ann Arbor Healthcare System

Transcribir

Para empezar, añade 70 microlitros de tampón acondicionador por cada mililitro de la infracción supernada libre de células del humor ocular. Agite las perlas de limpieza para mezclarlas bien. A continuación, agregue las perlas a la muestra, luego haga un vórtice de la muestra y las mezclas de perlas.

Centrifugar esta mezcla a 3000 G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Sin desalojar el gránulo, extraiga el supernadado, luego agregue un volumen igual de tampón de digestión de gránulos de orina al gránulo. Pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender el gránulo.

Ahora agregue proteinasa K a la mezcla de gránulos resuspendidos. Incubar la mezcla a 55 grados centígrados durante 30 minutos, luego agregar un volumen igual de tampón de lisis genómica a la mezcla de digestión. Agite bien la solución para mezclarla bien.

Ahora, coloque la columna de centrifugación disponible comercialmente en un nuevo tubo de recolección. Agregue 200 microlitros de tampón de preparación de ADN de orina a la columna de centrifugación. Centrifugar a 16.000 G durante un minuto a temperatura ambiente y desechar el flujo.

Ahora pipetee 700 microlitros de tampón de lavado de ADN de orina en la columna y centrifugue como se demuestra. Después de descartar el flujo, transfiera la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga sin DNasa y RNasa. Por último, agregue el volumen apropiado de tampón de elución de ADN directamente a la matriz de la columna y déjelo reposar durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente, luego centrifugue nuevamente para obtener ADN libre de células.

Los rendimientos de ADN de los componentes celulares y libres de células de los fluidos oculares fueron similares. Se realizó un análisis por PCR de los componentes celulares y libres de células de una mutación asociada al linfoma vitreorretiniano. Una mayor tasa de mutación estuvo presente en el componente libre de células, como lo demuestra un umbral de ciclo más bajo.

Explorar más videos

Vitreoretinal Lymphoma

PCR Analysis

DNA Yield

Conditioning Buffer

Urine Pellet Digestion Buffer

Genomic Lysis Buffer

Urine DNA Prep Buffer