Para comenzar, llene cada aguja con cinco microlitros de solución de nanocuerpo GFP marcada con Alexa Fluor. Coloque un cubreobjetos de 25 por 25 milímetros sobre una superficie deslizante de vidrio. Pipetear 40 microlitros de aceite de Halocarbon en el portaobjetos y extenderlo a lo largo del perímetro del cubreobjetos.
Bajo el microscopio de inyección, coloque la punta de la aguja contra el borde del cubreobjetos sumergido en aceite. Ajuste la presión del aire de inyección de la PicoPump en consecuencia. Reemplace el portaobjetos de vidrio vacío con el portaobjetos de embriones de Drosophila preparado.
Coloque la punta de la aguja de inyección perpendicular al eje anteroposterior del embrión. Use el manipulador de la etapa XY para guiar a los embriones hacia la aguja hasta que la punta llegue al centro de la yema, y bombee dos o tres veces para infundir anticuerpos en la yema. Con el manipulador de la etapa XY, aleje los embriones de la aguja después de la inyección y pase al siguiente embrión.
Dejar que los embriones se incuben a 25 grados centígrados hasta alcanzar la etapa de desarrollo deseada. Después de la incubación, identifique los embriones bajo una lente de baja potencia con iluminación de campo brillante y cambie a una lente de 40X o 63X para obtener imágenes fluorescentes en vivo de alta resolución. Después de la inyección, la relación señal-ruido del receptor notch mejora significativamente en comparación con la calidad de la señal de la inmunofluorescencia.
Además, la inyección de anticuerpos permitió la caracterización temporal de la localización de la muesca a intervalos de 45 segundos sin una pérdida aparente de la intensidad de la señal durante una ventana de imágenes de cinco minutos. Las imágenes en vivo de la fosfotirosina embrionaria mostraron que la fosforilación de la tirosina está altamente enriquecida en las uniones tricelulares. Además, se observó una nueva segunda población de señal de fosfotirosina debajo del centro de la membrana apical.
Las imágenes de doble color revelaron que esta población de señal de fosfotirosina está cerca de la miosina medial. Además, la población medial de fosfotirosina exhibió patrones de coalescencia y disipación pulsátil similares, como se muestra para la miosina medial.
