Nos gustaría agradecer a la Dra. Jennifer A. Zallen por proporcionar la línea Sqh-GFP Drosophila y el apoyo para el desarrollo inicial de esta técnica, y al Dr. Francois Schweisguth por proporcionar la línea Notch-GFP Drosophila . Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32270809) para H.H.Yu, el generoso apoyo financiero y de personal de la Escuela de Ciencias de la Vida, SUSTech, y el financiamiento a Y. Yan de la Comisión de Innovación Científica y Tecnológica de Shenzhen/JCYJ20200109140201722.

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y la aprobación de la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad SUSTech. El organismo utilizado es Drosophila melanogaster, y los genotipos son Notch-Knockin-GFP (Cromosoma X) y Sqh-sqh-GFP (Cromosoma II), generosamente proporcionados por los laboratorios del Dr. François Schweisguth (Instituto Pasteur) y la Dra. Jennifer Zallen (Instituto Sloan Kettering), respectivamente. Si bien este protocolo se centra principalmente en aspectos del marcaje de anticuerpos y las imágenes en vivo, consulte los informes publicados para obtener descripciones más detalladas de la recolección e inyección de embriones de Drosophila 15,16.
1. Marcaje fluorescente de anticuerpos
<ol><li>Preferiblemente, utilizar anticuerpos monoclonales o nanocuerpos para la proteína de interés. Prepare la concentración de anticuerpos en 1 mg/ml o más. NOTA: En este estudio, se utiliza como ejemplo el nanocuerpo GFP (ver Tabla de Materiales). El nanocuerpo GFP disponible en el mercado se envasa a una concentración de 1,0 mg/ml y un volumen de 250 μl. Además, se utiliza un kit de etiquetado de anticuerpos disponible en el mercado (véase la tabla de materiales), que conjuga Alexa Fluor 594 con aminas primarias de proteínas a través de una reacción de éster de succinimidilo11. Es importante destacar que este proceso de etiquetado no altera significativamente la concentración de anticuerpos.</li>
	<li>Prepare una solución de bicarbonato de sodio 1 M resuspendiendo el Componente B (incluido en el kit de etiquetado de anticuerpos) en 1 ml de agua desionizada.</li>
	<li>Ajuste la concentración de anticuerpos a 1,0 mg/ml, luego agregue 1/10de volumen (10 μl para 100 μl de nanocuerpo GFP) de la solución de bicarbonato de sodio 1 M.</li>
	<li>Agregue 110 μL de la mezcla de anticuerpos (del paso 1.3) directamente al tubo que contiene el colorante Alexa Fluor 594. Invierta para mezclar (no haga vórtice) e incubar en un rotador durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ensamble la columna de purificación a partir del kit de conjugación (consulte la Tabla de materiales). Prepare un lecho de resina de 1,5 ml (incluido en el kit de etiquetado de anticuerpos) y centrifugue la columna a 1100 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente (RT) para eliminar el exceso de líquido de la resina.</li>
	<li>Añadir la mezcla de reacción (del paso 1.4) gota a gota en la parte superior de la columna de resina y centrifugar a 1100 x g durante 5 min a 4 °C para recoger el anticuerpo marcado. El anticuerpo recolectado debe aparecer de color rosado y el volumen debe ser ligeramente inferior a 100 μL. Almacenar en tubos envueltos en papel de aluminio o de color oscuro a 4 °C.</li>
</ol>2. Preparación de embriones de Drosophila
<ol><li>Coloque 200 Drosophila adultas recién nacidas en una jaula de plástico en forma de cilindro (diámetro = 5 cm, altura = 8 cm) con una proporción de macho a hembra de 1: 10. Selle un lado con una malla metálica porosa para ventilar y el otro lado con una placa de agar de jugo de frutas/pasta de levadura.</li>
	<li>Cambiar la placa cada 12 h durante tres días antes de la recogida de embriones. Esto permite la sincronización de la puesta de huevos de Drosophila y mejora la eficiencia de la recolección.</li>
	<li>El día de la inyección, cambiar la jaula a una placa de zumo de frutas con un mínimo de pasta de levadura y recoger los embriones a 25 °C durante 1 h. Si la primera ronda de recolección no produce suficientes embriones (<50 embriones), deseche la primera placa y repita este paso para una segunda ronda de recolección hasta que se pongan más de 100 embriones en 1 h.</li>
	<li>Retirar la placa de la jaula para detener la puesta de huevos e incubar a 25 °C durante otras 2 h para obtener embriones de 2-3 h de edad. La etapa correcta de los embriones es fundamental para el éxito de la inyección de anticuerpos.</li>
	<li>Para quitar la cáscara de huevo de los embriones, agregue 2 ml de lejía al 50% a la placa de jugo de frutas y desaloje suavemente los embriones de la placa con un pincel (Figura 2A-4). A menudo, los embriones se colocan directamente sobre la pasta de levadura. En este caso, es aceptable cepillar la pasta de levadura en la solución de lejía para recolectar todos los embriones.</li>
	<li>Incubar los embriones flotantes en lejía al 50% durante 2 minutos y agitar la placa de jugo de frutas cada 30 s para mejorar la eficiencia de la eliminación de la cáscara del huevo.</li>
	<li>Transfiera la mezcla de embrión y lejía vertiéndola en un colador de células de nailon de 70 μm (Figura 2A-7). Lave bien los embriones con una botella de agua para eliminar cualquier residuo de lejía y pasta de levadura. Seque completamente el colador de células con toallas de papel, asegurándose de eliminar el exceso de agua alrededor de los embriones.</li>
</ol>3. Alineación y desecación embrionaria
<ol><li>Prepare un gel de agarosa al 4% de 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (ancho, largo, alto) (Figura 2A-9) y deje que el gel se enfríe a temperatura ambiente. Corte un bloque de agarosa de 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (ancho, largo, alto) con una cuchilla de afeitar limpia y coloque el bloque en un portaobjetos de vidrio (Figura 2A-2). Examine el bloque de gel debajo del endoscopio de disección para asegurarse de que los bordes estén cortados rectos y que la superficie esté plana y seca.</li>
	<li>Transfiere los embriones del colador al bloque de gel con un pincel. Extienda los embriones uniformemente a lo largo de la línea media del bloque cepillándolos suavemente. Lo ideal es que los grupos de embriones se separen en uno solo o en dobletes sin tocarse entre sí.</li>
	<li>Prepare una pinza con dos patas pegadas con cinta adhesiva para crear una sola punta fina (Figura 2A-5). Bajo un endoscopio de disección, recoja embriones individuales con la pinza y colóquelos a lo largo del borde largo del bloque de gel. Alinear 20-30 embriones, asegurándose de que su eje antero-posterior esté paralelo al borde (Figura 2C).</li>
	<li>Pipetear 10 μL de pegamento de heptano (ver Tabla de Materiales) en el centro de un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm (Figura 2A-1) y extender el pegamento en un área rectangular de 0,5 cm x 3 cm con la punta de una pipeta. Espere a que el pegamento se seque por completo antes de usarlo.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos de vidrio con el bloque de gel en el borde del escritorio, con los embriones hacia afuera. Levante el cubreobjetos con pegamento usando una pinza de punta plana (Figura 2A-6) y manténgalo quieto encima de los embriones, con el lado del pegamento mirando hacia los embriones en un ángulo inclinado de alrededor de 45 grados. NOTA: Presione suavemente el cubreobjetos contra el bloque de gel para que los embriones entren en contacto con el pegamento, y luego libere rápidamente la presión y levante el cubreobjetos. La cantidad de tensión aplicada es fundamental para que los embriones puedan adherirse de manera estable al pegamento sin ser presionados demasiado fuerte y reventar.</li>
	<li>Pipetear 10 μL de agua en el centro de un nuevo portaobjetos de vidrio y colocar el cubreobjetos con los embriones encima, con el lado del embrión hacia arriba (Figura 2B). Asegúrese de usar agua en lugar de esmalte de uñas u otro pegamento adhesivo para sujetar el cubreobjetos al portaobjetos de vidrio, ya que este lado del cubreobjetos se colocará directamente encima de la lente confocal para obtener imágenes en vivo.</li>
	<li>Secar los embriones en una cámara de desecación (Figura 2A-3) (ver Tabla de Materiales) durante 10-15 min hasta que la membrana vitelina se arrugue (Figura 2E). El tiempo requerido puede variar con la humedad de la habitación y debe probarse experimentalmente para cada condición de laboratorio.</li>
	<li>Pipetear 40 μL de aceite de halocarbono (una mezcla de tipo 27 y tipo 700 en una proporción de 1:1 en volumen, ver Tabla de Materiales) en un extremo de la tira embrionaria. Incline el portaobjetos hasta que el aceite de halocarbono cubra toda la superficie de los embriones.</li>
</ol>4. Inyección de anticuerpos e imágenes
<ol><li>Prepare algunas agujas de vidrio para inyección con un extractor de micropipetas (consulte la Tabla de materiales para conocer la configuración de los parámetros) y cargue cada aguja con 5 μl de solución de anticuerpos marcada con AlexaFluor (del paso 1.6).</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos de 25 mm x 25 mm encima de un portaobjetos de vidrio. Pipetear 40 μL de aceite de halocarbono y extenderlo a lo largo del borde del cubreobjetos.</li>
	<li>Debajo del endoscopio de inyección, alinee la punta de la aguja contra el borde del cubreobjetos debajo del aceite. Ajuste la presión de aire de inyección de la picobomba (consulte la Tabla de materiales) para que una bomba genere una burbuja llena de anticuerpos. El diámetro de la burbuja debe limitarse a 20-50 μm (Figura 2F).</li>
	<li>Reemplace el portaobjetos de vidrio vacío por uno que contenga embriones bajo aceite. Alinear la punta de la aguja de inyección perpendicularmente contra el eje antero-posterior de los embriones (Figura 2D, G).</li>
	<li>Verifique el estado de los embriones para asegurarse de que la mayoría hayan iniciado la celularización pero aún no hayan comenzado la gastrulación (etapa 4 y etapa 5), permaneciendo como un sincitio (Figura 2F, G). NOTA: El sello distintivo de esta etapa es la ausencia de surcos o pliegues y la presencia de un saco vitelino de forma ovalada y color oscuro visible en el centro del embrión. La caracterización morfológica de la etapa embrionaria bajo aceite se basa en el capítulo del libro "Etapas de la embriogénesis de Drosophila" de Volker Hartenstein17.</li>
	<li>Utilice el manipulador de la etapa X-Y para mover los embriones hacia la aguja hasta que la punta llegue al centro de la yema. Bombee dos o tres veces para inyectar anticuerpos en la yema. El éxito de la inyección está indicado por la rápida desaparición de la arruga de la membrana vitelina a medida que los embriones ganan volumen de la solución de anticuerpos (Figura 2G).</li>
	<li>Utilice el manipulador de la etapa X-Y para alejar los embriones de la aguja después de la inyección y moverlos hacia abajo hasta el siguiente embrión. Repita el paso 6 hasta que se inyecten todos los embriones en el portaobjetos.</li>
	<li>Transfiera el portaobjetos de vidrio con los embriones inyectados a una cámara de humedad (Figura 2A-8). Incubar a 25 °C hasta alcanzar la etapa deseada de desarrollo embrionario.</li>
	<li>Levante el cubreobjetos de 24 mm x 50 mm del portaobjetos de vidrio y colóquelo directamente en el portaobjetos del microscopio. El equipo sin embriones estará de cara a los objetivos. Localice los embriones usando una lente de bajo aumento bajo iluminación de campo brillante y cambie a una lente de 40x o 63x para obtener imágenes fluorescentes en vivo de alta resolución.</li>
</ol>

Mejora de la visualización de proteínas con imágenes en vivo mediadas por anticuerpos

<ol>
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Este procedimiento presentado describe el método especializado de marcaje de fluorescencia con anticuerpos personalizados y la posterior inyección en embriones de Drosophila en etapa temprana. Esta técnica facilita la visualización en tiempo real de proteínas o modificaciones postraduccionales que existen en pequeñas cantidades y que suelen ser difíciles de observar a través de los métodos convencionales de marcado GFP/mCherry.
Se debe tener precaución al extender este méto...

La inmunofluorescencia es una técnica fundamental de la biología celular moderna desarrollada originalmente por Albert Coons, que permite la detección de moléculas en sus compartimentos celulares nativos y la caracterización de las composiciones moleculares de orgánulos o maquinarias subcelulares1. Junto con las manipulaciones genéticas, la inmunofluorescencia ayuda a establecer el concepto ahora bien aceptado de que la localización de proteínas es esencial parasu función. Aparte de los anticuerpos primarios específicos y los colorantes fluorescentes brillantes, el éxito de esta técnica se basa en un proceso preliminar llamado fijación y permeabilización, que preserva las morfologías celulares, inmoviliza los antígenos y aumenta la accesibilidad de los anticuerpos a los compartimentos intracelulares. Inevitablemente, el proceso de fijación y permeabilización mataría a las células y terminaría con todos los procesos biológicos3. Por lo tanto, la inmunofluorescencia solo proporciona instantáneas del viaje de la vida de las proteínas. Sin embargo, muchos procesos biológicos, como la migración y la división celular, son de naturaleza dinámica, lo que requiere la investigación del comportamiento de las proteínas de una manera resuelta espacio-temporalmente 4,5.
Para examinar la dinámica de las proteínas en los organismos vivos, se han desarrollado métodos de imagen en vivo basados en proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, como la proteína fluorescente verde (GFP)6 y microscopios confocales de alta velocidad. Brevemente, la proteína de interés puede ser manipulada genéticamente para ser fusionada con GFP7, y luego expresada ectópicamente a partir de promotores virales o de levaduras como el citomegalovirus (CMV)8 o la secuencia de activación ascendente (UAS)9. Debido a que la GFP es de naturaleza autofluorescente, no se requieren anticuerpos acoplados a fluoróforos para revelar la localización de las proteínas diana, lo que evita la necesidad de procesos preliminares de fijación o permeabilización. A lo largo de las últimas dos décadas, se han desarrollado etiquetas fluorescentes que abarcan todo el espectro de longitudes de onda10, lo que permite obtener imágenes en vivo multicolor de varias proteínas diana al mismo tiempo. Sin embargo, en comparación con los colorantes fluorescentes de ingeniería química como AlexaFluor o ATTO, la autofluorescencia de estas proteínas fluorescentes codificadas genéticamente es relativamente débil e inestable cuando se expresa a partir de promotores endógenos, especialmente durante la obtención de imágenes en vivo en escalas de tiempo más largas10. Si bien este déficit puede mitigarse mediante la sobreexpresión de proteínas diana marcadas con fluorescencia, muchas con actividades enzimáticas como quinasas y fosfatasas interrumpen gravemente los procesos biológicos normales si no se expresan a niveles fisiológicos.
Este protocolo presenta un método que permite la iluminación de dianas basada en anticuerpos fotoestables en una configuración de imagen en vivo, lo que esencialmente permite la inmunofluorescencia sin el proceso de fijación o permeabilización (Figura 1). A través de una simple reacción de amina primaria basada en NHS11, se pueden conjugar colorantes fluorescentes como AlexaFluor 488 o 594 con esencialmente cualquier anticuerpo primario o GFP/HA/Mycnanobody 12. Aprovechando una característica del desarrollo de que todas las células embrionarias de Drosophila comparten un citoplasma común durante la etapa13 de sincitio, se puede lograr la unión al antígeno y la iluminación en embriones enteros después de la inyección de anticuerpos conjugados con colorante. Con la expansión de las bibliotecas de proteínas marcadas endógenamente disponibles en Drosophila y otros sistemas modelo14, este método puede ampliar potencialmente las aplicaciones de estas bibliotecas al revelar la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia de baja abundancia y otras proteínas marcadas con fluorescencia (marcadas con HA/Myc) en tejidos vivos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

La visualización de proteínas en células vivas utilizando GFP (proteína fluorescente verde) y otras etiquetas fluorescentes ha mejorado en gran medida la comprensión de la localización, la dinámica y la función de las proteínas. En comparación con la inmunofluorescencia, las imágenes en vivo reflejan con mayor precisión la localización de proteínas sin posibles artefactos que surjan de la fijación tisular. Es importante destacar que las imágenes en vivo permiten la caracterización cuantitativa y temporal de los niveles y la localización de proteínas, lo que es crucial para comprender los procesos biológicos dinámicos, como el movimiento o la división celular. Sin embargo, una limitación importante de los enfoques de marcado fluorescente es la necesidad de niveles de expresión de proteínas suficientemente altos para lograr una visualización exitosa. En consecuencia, no se pueden detectar muchas proteínas fluorescentes marcadas endógenamente con niveles de expresión relativamente bajos. Por otro lado, la expresión ectópica mediante promotores virales puede conducir a veces a una mala localización de proteínas o a alteraciones funcionales en contextos fisiológicos. Para abordar estas limitaciones, se presenta un enfoque que utiliza la detección de proteínas mediadas por anticuerpos de alta sensibilidad en embriones vivos, esencialmente realizando inmunofluorescencia sin necesidad de fijación tisular. Como prueba de principio, el receptor Notch marcado con GFP endógeno que apenas es detectable en embriones vivos se puede visualizar con éxito después de la inyección de anticuerpos. Además, este enfoque se adaptó para visualizar las modificaciones postraduccionales (PTM) en embriones vivos, lo que permitió detectar cambios temporales en los patrones de fosforilación de tirosina durante la embriogénesis temprana y reveló una nueva subpoblación de fosfotirosina (p-Tyr) debajo de las membranas apicales. Este enfoque puede modificarse para adaptarse a otros anticuerpos específicos de proteínas, específicos de etiquetas o específicos de PTM y debe ser compatible con otros organismos o líneas celulares modelo susceptibles de inyección. Este protocolo abre nuevas posibilidades para la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o PTM que antes eran difíciles de detectar con los métodos tradicionales de marcado fluorescente.

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

Autor destacado: Desvelando la dinámica de las señales mecánicas y bioquímicas en la investigación de la morfogénesis animal 

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

Para demostrar las ventajas del método de inyección de anticuerpos sobre las imágenes vivas basadas en marcadores fluorescentes o la inmunofluorescencia, se proporcionan dos estudios de caso que caracterizan la localización dinámica de un receptor transmembrana de baja abundancia, Notch, y un tipo de modificación postraduccional llamada fosforilación de tirosina en embriones vivos.
La actividad de señalización de Notch juega un papel importante en la determinación del destino celular...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research at JoVE.com

Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Nuestro objetivo es comprender cómo las señales mecánicas y bioquímicas correlacionan la morfogénesis animal, incluida la detección y la respuesta a las fuerzas de las células y las moléculas. Se han descubierto más moléculas que son mecanosensibles, que funcionan de manera diferente bajo diferentes niveles de tensión. Sin embargo, el contexto fisiológico y la función de estos eventos sensibles a la fuerza siguen siendo en gran medida desconocidos.Debido a la naturaleza dinámica de los eventos sensibles a la fuerza, nuestro campo se basa en gran medida en imágenes de fluorescencia de alta velocidad y grabación de lapso de tiempo para capturar comportamientos moleculares y celulares. Muchas proteínas marcadas con fluorescencia no son lo suficientemente brillantes como para ser fotografiadas, y requiere una resolución espacio-temporal sin una decoloración significativa. Por otro lado, los métodos tradicionales de inmunofluorescencia solo pueden capturar una instantánea de la fijación molecular y celular después de la fijación.Este método allana el camino para rastrear dinámicamente la localización de muchos receptores de proteínas de baja abundancia de las principales vías de señalización, como las vías Notch, Wnt y BMP. Eventualmente, además de las cascadas de señalización lineal tradicionales, podemos identificar y dónde ocurren los eventos de señalización a escalas subcelulares.

visualizing-low-abundance-proteins-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

664 vistas.  SUSTech University. Nuestro objetivo es comprender cómo las señales mecánicas y bioquímicas correlacionan la morfogénesis animal, incluida la detección y la respuesta a las fuerzas de las células y las moléculas. Se han descubierto más moléculas que son mecanosensibles, que funcionan de manera diferente bajo diferentes niveles de tensión. Sin embargo, el contexto fisiológico y la función de estos eventos sensibles a la fuerza siguen siendo en gran medida desconocidos.Debido a la naturaleza di...

Video: Autor destacado: Desvelando la dinámica de las señales mecánicas y bioquímicas en la investigación de la morfogénesis animal 

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.