Para comenzar, tome células Calu6 transfectadas con microARN EV conjugado con fluoróforos y microARN celular. Filtre la suspensión celular a través de una tapa de filtro de 35 micrómetros incluida con los tubos FACS de poliestireno de fondo redondo. A continuación, configure el instrumento de citometría de flujo, encienda el citómetro de flujo y deje que se caliente durante 30 minutos antes de usarlo.
Imprime el sistema fluídico con líquido de vaina. Después de eso, verifique y ajuste la alineación del láser. Para el control de calidad, cargue agua filtrada ultrapura en el citómetro de flujo y hágala funcionar a un caudal adecuado, asegurando un tiempo de adquisición adecuado.
A continuación, establezca el umbral para capturar la señal de las células Calu6 a FSC 5, 000. Para tener en cuenta la superposición espectral entre fluoróforos, prepare controles de compensación utilizando células no transfectadas y células transfectadas con un solo fluoróforo. Realice análisis de expresión en celdas transfectadas utilizando los canales FSC, SSC, FITC y PE configurados en 258, 192, 269 y 423 unidades de voltaje respectivamente.
A continuación, introduzca la muestra de control negativo en el citómetro de flujo. Capture las señales de la célula después de definir las intensidades FSC y SSC en una hoja de trabajo personalizada. Seleccione FSC para el eje X y SSC para el eje Y en la gráfica.
Dibuje un polígono alrededor de la población de interés para crear una puerta en el eje. Para crear una nueva gráfica utilizando la población controlada, establezca el eje X en señal fluorescente 1. Para la detección de microARN celular y el eje Y a la señal fluorescente 2 para la detección de microARN EV.
Establecer parámetros de compensación para los fluoróforos individuales utilizando células transfectadas de forma independiente con cada uno de los microARN marcados con fluorescencia. El análisis por citometría de flujo de las células transfectadas con microARN celular y microARN EV reveló una disminución secuencial de la señal de fluorescencia correspondiente al microARN EV. Por el contrario, la señal correspondiente al microARN celular se retuvo en las células, lo que indica que el fluoróforo no afecta la retención de microARN por parte de las células.
