Agradecemos el apoyo y los consejos de la Dra. Jill Hutchcroft, Directora del Centro Central de Citometría de Flujo de la Universidad de Purdue. Este trabajo fue apoyado por R01CA226259 y R01CA205420 a A.L.K., un Premio a la Innovación de la Asociación Americana del Pulmón (ANALA2023) IA-1059916 a A.L.K., una P30CA023168 de subvención del centro de recursos compartidos de Purdue y una beca de doctorado Fulbright otorgada por el Departamento de Estado, EE. UU. a H.H.

NOTA: Como requisito previo para utilizar esta técnica, se requiere la identificación y validación de los miARN exportados selectivamente. Dado que las diferentes líneas celulares varían en función de la carga de miARN clasificada en sus EV, se recomienda que la línea celular de interés y las VE asociadas se evalúen en busca de miARN antes de su uso. Además, la transfección basada en lipofectamina es uno de los pasos críticos del protocolo; Se recomienda predeterminar la eficiencia de la transfección antes de configurar el experimento.
1. Células en cultivo y transfección de células con EV-miRNA conjugado con fluoróforos
<ol><li>Coloque de 200.000 a 400.000 células en pocillos triplicados en una placa de 6 pocillos en un medio de cultivo apropiado. Gire suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar las células hasta que alcancen el 70%-80% de confluencia, aproximadamente 24-48 h.</li>
	<li>Para cada pocillo a transfectar, diluir el reactivo de transfección en 100 μL de medio libre de suero en un tubo de microcentrífuga de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: La concentración óptima de lípidos debe determinarse para la línea celular de interés antes de esta configuración.</li>
	<li>Para cada pocillo que se va a transfectar, diluir el EV-miRNA conjugado con fluoróforos (2nM) y el miRNA celular (2nM) por separado en un tubo de microcentrífuga en 100 μL de medio libre de suero. NOTA: El volumen total debe calcularse para el número total de pozos transfectados. En este protocolo, la fluorescencia se evaluó en 7 puntos temporales; por lo tanto, el volumen total fue de 700 μL para el paso 1.2 y de 700 μL para el paso 1.3. Además, para capturar con confianza la población fluorescente positiva de células, el usuario debe transfectar células con un miARN codificado no fluorescente y establecer una puerta que excluya estas células.</li>
	<li>Añadir la mezcla de ARN diluido (del paso 1.3) al reactivo de transfección diluido (del paso 1.2) y mezclar suavemente invirtiendo el tubo 3-4 veces. Deje que la mezcla combinada de lípidos y ARN se incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Retire el medio de cultivo normal de las células y agregue 800 μL de medio sin suero a cada pocillo. Añadir suavemente 200 μL de la mezcla de lípidos y ARN (del paso 1.4) gota a gota a las células. NOTA: Se utilizó el medio Opti-MEM para transfectar la línea celular de interés (células Calu6). Trate de agregar la mezcla de lípidos y ARN directamente al medio de cultivo, evitando agregar la mezcla a los lados de la placa.</li>
</ol>2. Recolección de células transfectadas en varios puntos de tiempo para el análisis de fluorescencia
<ol><li>Incubar las células transfectadas a 37 °C durante 7 h. NOTA: Para validar la transfección consistente de ambos miARN (EV-miRNA y miARN celular), se recolectan células de un pocillo 3 h después de la transfección para analizar la fluorescencia utilizando el citómetro de flujo.</li>
	<li>Después del período de incubación de 7 h, retire el complejo de transfección de los pocillos y reemplácelo con medios completos.</li>
	<li>Para evaluar el punto de tiempo de 7 h, recoja las células y lávelas tres veces con 1x PBS.<ol><li>Si trabaja con células adherentes, agregue 200 μL de tripsina a un pocillo y espere a que las células se desprendan de la placa. Transfiera las células desprendidas a un tubo de microcentrífuga y gránulos por centrifugación a 200xg durante 5 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante con cuidado para evitar alterar el gránulo de la célula. Para el primer lavado de PBS, vuelva a suspender el gránulo en ~ 500 μL de 1x PBS y repita la granulación siguiendo los pasos de centrifugación anteriores. Repita el lavado con PBS dos veces más.</li>
		<li>Vuelva a suspender el gránulo celular en 200 μL de solución de paraformaldehído (PFA) al 2% y evalúe la fluorescencia. NOTA: Después de agregar un 2% de PFA, el gránulo celular se puede almacenar a 4 °C durante 3-4 días. </li>
	</ol></li>
	<li>Coseche los puntos de tiempo restantes siguiendo los pasos de la sección 2.3. Recoja todos los gránulos de celda almacenados y continúe con los pasos de la sección 3.</li>
</ol>3. Análisis de citometría de flujo de la señal célula-miRNA y EV-miRNA en células
<ol><li>Preparar las células para el análisis de citometría de flujo. Filtre la suspensión celular de la sección 2 a las tapas de filtro de 35 μm que forman parte de los tubos FACS de poliestireno de fondo redondo para permitir la eliminación de desechos y agregados celulares que puedan interferir con el análisis de fluoróforos.</li>
	<li>Configure el instrumento siguiendo las instrucciones de calibración. Encienda el citómetro de flujo y deje que se caliente durante al menos 30 minutos antes de usarlo. Prepare el sistema de fluídica con líquido de vaina y verifique y ajuste la alineación del láser.</li>
	<li>Ejecute el control de calidad para confirmar la fluídica del instrumento. Cargue agua filtrada ultrapura en el citómetro de flujo y hágalo funcionar a un caudal adecuado para un tiempo de adquisición adecuado. NOTA: El caudal y el tiempo de adquisición adecuados dependerán del tipo de celda de interés, la complejidad de la muestra y la calidad de datos deseada.</li>
	<li>Abra el software de análisis de datos de citometría de flujo y confirme el rendimiento del detector y los láseres. Configure parámetros de umbral y voltaje para la detección en función de la línea celular de interés y los fluoróforos elegidos. NOTA: Para todos los experimentos posteriores, se utilizaron células Calu6.<ol><li>Establezca el umbral para capturar la señal de las celdas Calu6 en FSC 5000. Realice el análisis para 1 x 104 celdas para cada repetición experimental.</li>
		<li>Para tener en cuenta la superposición espectral entre diferentes fluoróforos, utilice células no transfectadas y células transfectadas de forma independiente con solo uno de los fluoróforos para establecer controles de compensación.</li>
		<li>Para la detección de la exportación de miARN, utilice EV-miRNAs candidatos (miR-451a y miR-150) conjugados con Alexa-fluor 488, y una célula de control-miRNA (cel-miR-67) conjugada con Cy3.</li>
		<li>Para cada EV-miRNA, conjuge el fluoróforo con el extremo 5′ de la hebra 5p. Antes de la transfección, recocer la hebra conjugada con fluoróforos a su hebra 3p 100% complementaria.</li>
		<li>Para el análisis de expresión en células transfectadas, analice las muestras utilizando los canales FSC, SSC, FITC y PE configurados en 258, 192, 269 y 423 unidades de voltaje, respectivamente (Figura 1A, B).</li>
	</ol></li>
	<li>Introduzca la muestra de control negativo en el citómetro de flujo. Capture las señales de la célula después de definir las intensidades de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) en una hoja de cálculo personalizada.</li>
	<li>En la gráfica, elija FSC para el eje X, SSC para el eje Y y puerta para la población de interés dibujando un polígono a su alrededor (consulte la Figura 1B, panel inferior).</li>
	<li>Cree una nueva parcela utilizando la población cerrada.<ol><li>Establezca el eje X en la señal de fluorescencia 1 (FS1) para la detección de miARN celular y el eje Y en la señal de fluorescencia 2 (FS2) para la detección de miARN EV. Establezca parámetros de compensación para los fluoróforos individuales utilizando células transfectadas de forma independiente con cada uno de los miARN marcados con fluorescencia. En la nueva parcela, puerta sobre la población de interés.</li>
		<li>Para la detección de miARN EV, utilice el canal FITC. Para la evaluación de la señal célula-miARN, utilice el canal PE. En el software, cree una puerta alrededor de las celdas que fueron positivas tanto para FITC como para PE dibujando un polígono alrededor de la población de doble fluorescencia cuando se seleccionó FITC para el eje X y PE para el eje Y.</li>
	</ol></li>
	<li>Registre las estadísticas de la población cerrada.<ol><li>Registre el porcentaje de células en la población cerrada que son positivas tanto para FITC como para PE, así como para aquellas que son positivas para FITC o PE.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita los pasos anteriores para cualquier muestra o control adicional en el experimento.</li>
</ol>4. Aislamiento de las VE de las células transfectadas
<ol><li>En el caso de las células cultivadas en medios que contienen suero, se deben agotar los VE del suero para evitar la contaminación cruzada.<ol><li>Para generar suero agotado en EV, diluir el suero al 50% en medios de cultivo celular para reducir la viscosidad y centrifugar el suero resultante al 50% a 110.000 x g durante 18 h.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante (suero libre de EV) con cuidado y fíltrelo con un conjunto de filtro de 0,2 μm. Utilice el suero resultante 50% libre de EV para generar medios completos, en este caso, RPMI más 10% de suero.</li>
		<li>Para recolectar los EV, agregue el medio completo agotado de EV a las celdas y recoja los EV 48 h después de la incubación. NOTA: El protocolo que se describe a continuación ha sido modificado a partir de Kowal et al.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultive células en placas de cultivo de tejidos de 15 cm hasta una confluencia del 80%. Transfectar las células por separado con miRNA celular y miARN EV en 10 ml de Opti-MEM siguiendo el protocolo de transfección de la sección 1 del protocolo. NOTA: No todos los protocolos de transfección se escalan linealmente. Puede ser esencial adaptar y evaluar primero las condiciones de transfección en placas de 15 cm.</li>
	<li>Después de 7 h, aspire el medio de transfección y reemplácelo con el medio agotado de EV (15 mL). Cultive células en el medio agotado de EV durante 48 h.</li>
	<li>Retire el medio acondicionado de las células y dispense en un tubo de centrífuga de 50 ml dentro de la cabina de bioseguridad. Centrifugar el medio acondicionado a 2000 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar las células muertas y los restos celulares. Transfiera el sobrenadante resultante a un tubo nuevo.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 10.000 x g durante 40 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y fíltrelo con un conjunto de filtro de 0,2 μm.</li>
	<li>Transfiera los medios de cultivo celular filtrados a un tubo de ultracentrífuga estéril dentro de la cabina de bioseguridad. Pesa y equilibra los tubos entre sí. Centrifugar las muestras a 110.000 x g durante 90 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en un volumen adecuado de 1x PBS para lavar y centrifugar a 110.000 x g durante 90 min 4 °C. NOTA: El gránulo EV se resuspendió en 60 mL de 1x PBS según el volumen máximo permitido para los tubos de rotor de ángulo fijo utilizados en este estudio.</li>
	<li>Aspire PBS y suspenda el gránulo EV en un volumen adecuado (50-100 μL) de PBS fresco 1x y vórtice. Almacene los vehículos eléctricos a -80 °C para su uso posterior.</li>
</ol>5. Análisis por citometría de flujo de la señal célula-miRNA y EV-miRNA en EV
<ol><li>Para preparar la suspensión de EV para el análisis de citometría de flujo, diluya los EV en un volumen adecuado de PBS 1x ultrafiltrado. NOTA: El volumen de carga para el análisis de citometría de flujo de VE debe determinarse en función del número de VE en las muestras. Aproximadamente, si hay ~30.000 partículas en la suspensión EV, el volumen final debería ser de ~500-600 μL en 1x PBS. Una muestra limpia tiene alrededor de 35-50 partículas/μL.</li>
	<li>Utilice el citómetro de nanoflujo o un equipo alternativo lo suficientemente potente como para analizar partículas de tamaño nanométrico. NOTA: En este caso, se utilizó el citómetro de nanoflujo Attune NxT.</li>
	<li>Abra el software y configure el instrumento siguiendo las instrucciones de calibración recomendadas. Realice la prueba de rendimiento utilizando nanoperlas de rendimiento. Si las nanoperlas se detectan en el rango de tamaño estándar, el rendimiento es óptimo. Determinar el caudal adecuado para la detección de partículas EV.</li>
	<li>Ejecute el control de calidad utilizando agua filtrada ultrapura para confirmar la fluídica del instrumento y el rendimiento del detector y los láseres.</li>
	<li>Usando perlas de calibración adecuadas para el experimento, configure el citómetro de flujo para detectar con precisión perlas de diferentes tamaños y medir las señales de fluorescencia. NOTA: Para la configuración del análisis EV por citometría de flujo, se utilizaron perlas ApogeeMix. Estas perlas contienen una mezcla de perlas de sílice no fluorescentes y perlas de poliestireno fluorescente que varían en tamaños de 80 nm a 1300 nm.<ol><li>Configure los parámetros para evaluar la sensibilidad y la resolución de diferentes poblaciones en la mezcla de perlas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice la compuerta adecuada para resolver la población de cordones a partir del ruido del instrumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Agite las muestras a fondo para distribuir uniformemente los vehículos eléctricos antes de cargarlos para su análisis.</li>
	<li>Abra el software de análisis de datos de citometría de flujo e introduzca el PBS ultrafiltrado. Configure la compuerta para las partículas de EV utilizando PBS ultrafiltrado mientras se asegura de que la compuerta corresponda al tamaño adecuado de partículas en función de las perlas en el paso 5.5.</li>
	<li>Cargue la muestra de control negativo para analizar los EV a medida que pasan por el citómetro de flujo. Capture señales EV mientras traza FSC en el eje X y SSC en el eje Y. NOTA: El umbral de SSC para capturar vehículos eléctricos se estableció en 300. El volumen de adquisición se fijó en 95 μL de un total de 145 μL de volumen estirado. El caudal se fijó en 12,5 μL/min. El análisis se realizó con partículas 1 x 106 EV. La población de vehículos eléctricos es heterogénea y dará lugar a algunos escombros aislados junto con los vehículos eléctricos. La detección general de partículas en el gráfico FSC vs. SSC destaca las partículas en un rango diverso, lo que se espera cuando se utilizan preparaciones de EV crudo.</li>
	<li>Cree una nueva parcela utilizando la población cerrada.<ol><li>Esta vez, elija la señal de fluorescencia 1 (FS1) para la detección de miARN celular en el eje X y la señal de fluorescencia 2 (FS2) para la detección de miARN EV en el eje Y.</li>
		<li>Configure los parámetros de compensación para los fluoróforos utilizando las muestras de EV aisladas de células transfectadas con un solo miARN. En la nueva parcela, puerta de entrada a la población de vehículos eléctricos de interés.</li>
		<li>Para el análisis de la expresión de miARN conjugados con fluoróforos en EV aislados de las células transfectadas, analice las muestras de EV utilizando los canales FSC, SSC, BL1 e YL1 configurados en 370, 370, 400 y 400 unidades de voltaje, respectivamente (Figura 2A, B).</li>
		<li>Registre las estadísticas de la población cerrada y visualícelas mediante histogramas y diagramas de puntos.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita los pasos anteriores para cualquier muestra o control adicional en el experimento.</li>
</ol>6. Validación de la liberación de miRNAs en VE a través de qRT-PCR
<ol><li>Extraiga el ARN de los VE y las células madre utilizando el kit de aislamiento de ARN miRVana siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: La cuantificación del ARN aislado de los VE no es posible porque la cantidad total de ARN aislado de los VE no suele cruzar el umbral de cantidad mínima de una nanogota estándar. Esto se debe al agotamiento del ARN ribosómico de las muestras de EV, que se puede validar con el Bioanalizador Agilent. Por lo tanto, la puntuación de integridad para la cuantificación de ARN-EV no suele ser fiable y no es la verdadera representación de la cantidad de ARN-EV. Por lo tanto, para la cuantificación de qRT-PCR del ARN-EV y el ARN celular, se utilizaron volúmenes iguales de aislados de ARN después del aislamiento de un número igual de células. Para la normalización de la qRT-PCR, se utilizaron miARN presentes de forma ubicua en múltiples muestras, según lo determinado a partir de los datos de secuenciación de ARN adquiridos previamente.</li>
	<li>Convierta el ARN extraído en ADNc utilizando un kit de transcriptasa inversa específico para ARN pequeños.</li>
	<li>Configure la reacción qRT-PCR utilizando una plantilla de ADNc y cebadores específicos de miARN siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: Para los experimentos de validación, se utilizó el kit de PCR miRCURY LNA qRT y los cebadores correspondientes del fabricante para evaluar la expresión de miARN celular y miARN EV.</li>
</ol>

Un protocolo de citometría de flujo para comprender los mecanismos de exportación

<ol>
	<li>Kasinski, A. L., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+en+route+to+the+clinic:+Progress+in+validating+and+targeting+microRNAs+for+cancer+therapy.">MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li><li>Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FolamiRs:+Ligand-targeted,+vehicle-free+delivery+of+microRNAs+for+the+treatment+of+cancer.">FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer.</a> Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).</li><li>Orellana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+microRNA+activity+through+increased+endosomal+release+mediated+by+nigericin.">Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin.</a> Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).</li><li>Abdelaal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first-in-class+fully+modified+version+of+miR-34a+with+outstanding+stability,+activity,+and+anti-tumor+efficacy.">A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy.</a> Oncogene. , (2023).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles:+Apoptotic+bodies,+microvesicles+and+exosomes.">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Hasan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+by+non-small+cell+lung+cancer+cells+drive+invasion+and+permeability+in+non-tumorigenic+lung+epithelial+cells.">Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Villarroya-Beltri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylated+hnRNPA2B1+controls+the+sorting+of+miRNAs+into+exosomes+through+binding+to+specific+motifs.">Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs.</a> Nature Communications. 4, 2980 (2013).</li><li>Cha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS-dependent+sorting+of+miRNA+to+exosomes.">KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes.</a> elife. 4, e07197 (2015).</li><li>Gandham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+and+standardization+in+research+on+extracellular+vesicles.">Technologies and standardization in research on extracellular vesicles.</a> Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Sork, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+interplay+of+the+extracellular+vesicle+small+RNA+transcriptome+and+proteome.">Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282 (2011).</li><li>Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+export+into+extracellular+vesicles+and+function+of+tRNA+fragments+during+T+cell+activation.">Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation.</a> Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).</li><li>Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-125b-5p+impacts+extracellular+vesicle+biogenesis,+trafficking,+and+EV+subpopulation+release+in+the+porcine+trophoblast+by+regulating+ESCRT-dependent+pathway.">miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway.</a> The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo recientemente establecido permite capturar la cinética de liberación de miARN en los VE después de la transfección de los MIARN de EV. El enfoque permite el análisis simultáneo de múltiples EV-miRNAs y miRNAs celulares, sujeto a las capacidades del citómetro. Además, aunque el análisis de citometría de flujo puede proporcionar información valiosa sobre la biología de los miARN de los VE, no está exento de limitaciones. Sin embargo, algunas de las limitaciones pueden superarse cuando se utilizan...

Los microARN (miARN) son uno de los subconjuntos mejor caracterizados de pequeños ARN no codificantes, que son conocidos por su papel fundamental en la regulación génica postranscripcional. La expresión y la biogénesis de la mayoría de los miRNAs siguen una serie coordinada de eventos que comienza con la transcripción de los miRNAs primarios (pri-miRNAs) en el núcleo. Después del procesamiento nuclear por el complejo del microprocesador en miARN precursores (pre-miARN), los pre-miARN se exportan al citoplasma, donde se someten a un procesamiento adicional por la endonucleasa ARNasa III, en dúplex de miARN maduros de 21-23 nucleótidos1. Una de las hebras del miARN maduro procesado se une a los ARN mensajeros (ARNm) diana, lo que conduce a la degradación o represión traduccional de las dianas2. Sobre la base del papel pleiotrópico de los miARN en la regulación simultánea de múltiples ARNm diana diversos, no es sorprendente que la expresión de miARN esté estrictamente regulada3. De hecho, la expresión inapropiada contribuye a varios estados de enfermedad, especialmente en el cáncer. La expresión aberrante de miRNAs no solo representa una firma específica de la enfermedad, sino que también ha surgido como una diana para el potencial pronóstico y terapéutico 4,5,6. Además de sus funciones intracelulares, los miARN también tienen funciones no autónomas. Por ejemplo, las células donantes pueden empaquetar selectivamente los miARN en VE y exportarlos a los sitios receptores, donde provocan diversas respuestas fenotípicas en la fisiología normal y de la enfermedad 7,8,9.
A pesar de la clara evidencia de que los miRNAs asociados a EV son biomoléculas funcionales, no se comprende completamente cómo subconjuntos específicos de miRNAs están desregulados en estados patológicos como el cáncer y cómo la maquinaria celular selecciona y clasifica los miRNAs enEvs 10,11. Dado el papel potencial de los miARN EV en la modulación del microambiente, es fundamental identificar los mecanismos implicados en la exportación de miARN seleccionados para dilucidar completamente el papel de los VE en la comunicación intercelular y la patogénesis de la enfermedad. Comprender el proceso de liberación de miARN en los VE no solo destacará los mediadores importantes de la exportación de miARN, sino que también puede proporcionar información sobre posibles terapias. Para alcanzar este nivel de conocimiento, es necesario adaptar las herramientas para abordar fielmente estas nuevas preguntas experimentales. De hecho, los estudios que evalúan los VE están creciendo exponencialmente debido a la introducción de nuevas técnicas y controles12,13. En relación con la evaluación de la abundancia de miRNAs exportados a VE, la secuenciación de nueva generación y la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) han sido las herramientas estándar actuales. Si bien estas herramientas son útiles para evaluar la abundancia de miARN en los VE, existen limitaciones en cuanto a su sensibilidad y especificidad, y el uso de estos enfoques estáticos para evaluar la dinámica es insuficiente. Delinear la dinámica de la exportación de miARN a los VE requiere una combinación de herramientas especializadas. Aquí, presentamos un protocolo completo que utiliza miARN conjugados con fluorescencia, para analizar la dinámica de la liberación de miARN de las células donantes y la incorporación a los VE. También discutimos las ventajas y limitaciones del método y brindamos recomendaciones para un uso óptimo. El método versátil presentado en este artículo será útil para los investigadores interesados en estudiar la liberación de miARN en los VE y sus posibles funciones en la comunicación celular y la enfermedad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 &#38; Si180/240/300/590/880/1300 nm)&#160;</td>
			<td>Apogee Flow Systems</td>
			<td>1527</td>
			<td>To set up gating and parameters for particle detection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Nxt Flow Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For fluorescence analysis in EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For fluorescence analysis in cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Maintaining temperature of 37&#160;&#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture medium</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>specific for the cell-line of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line of interest&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)</td>
			<td>Horizon discovery</td>
			<td>CP-004500-01-05</td>
			<td>miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 1x PBS (for cell culture)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAimax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA Reverse Transcriptase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA SYBR Green PCR</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>339347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana RNA Isolation</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4387936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ61899AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir nonsterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3004201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking mirna release into extracellular vesicles using flow cytometry

Las vesículas extracelulares (VE) son mediadores importantes de la comunicación celular que son secretadas por una variedad de células diferentes. Estos VE transportan moléculas bioactivas, incluidas proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (ADN, ARNm, microARN y otros ARN no codificantes), de una célula a otra, lo que tiene consecuencias fenotípicas en las células receptoras. De todas las diversas cargas de VE, los microARN (miARN) han atraído una gran atención por su papel en la configuración del microambiente y en la educación de las células receptoras debido a su clara desregulación y abundancia en los VE. Los datos adicionales indican que muchos miARN se cargan activamente en los VE. A pesar de esta clara evidencia, la investigación sobre la dinámica de la exportación y los mecanismos de clasificación de miARN es limitada. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza el análisis de citometría de flujo de EV-miRNA que se puede utilizar para comprender la dinámica de la carga de EV-miRNA e identificar la maquinaria involucrada en la exportación de miRNA. En este protocolo, los miARN predeterminados para enriquecerse en VE y agotarse de las células del donante se conjugan con un fluoróforo y se transfectan en las células del donante. A continuación, se verifica la carga de los miARN marcados con fluorescencia en los VE y el agotamiento de las células mediante qRT-PCR. Como control de transfección y como herramienta para controlar la población transfectada de células, se incluye un ARN celular marcado con fluorescencia (retenido por células y agotado por EV). Las células transfectadas tanto con el miARN EV como con el miARN retenido por células se evalúan en busca de señales fluorescentes en el transcurso de 72 h. La intensidad de la señal de fluorescencia específica para los miARN EV disminuye rápidamente en comparación con el miARN retenido en la célula. Utilizando este sencillo protocolo, ahora se podría evaluar la dinámica de la carga de miARN e identificar varios factores responsables de la carga de miARN en los VE.

MicroRNAs (miRNAs) are one of the best-characterized subsets of small noncoding RNAs, which are known for their critical role in post-transcriptional gene regulation. The expression and biogenesis of most miRNAs follow a coordinated series of events that begins with transcription of the primary miRNAs (pri-miRNAs) in the nucleus. Following nuclear processing by the microprocessor complex into precursor-miRNAs (pre-miRNAs), the pre-miRNAs are exported to the cytoplasm, where they undergo further processing by the RNase III endonuclease, dicer into 21-23 nucleotide mature miRNA duplexes1. One of the strands of the processed mature miRNA binds to target messenger RNAs (mRNAs), leading to degradation or translational repression of the targets2. Based on the pleiotropic role of miRNAs in simultaneously regulating multiple diverse target mRNAs, it is not surprising that miRNA expression is tightly regulated3. Indeed, inappropriate expression contributes to various disease states, especially in cancer. The aberrant expression of miRNAs not only represents a disease-specific signature but has also emerged as a target for prognostic and therapeutic potential4,5,6. In addition to their intracellular roles, miRNAs also have non-autonomous roles. For example, miRNAs can be selectively packaged into EVs by donor cells and exported to recipient sites where they elicit diverse phenotypic responses in normal and disease physiology7,8,9.
Despite clear evidence that EV-associated miRNAs are functional biomolecules, it is not completely understood how specific subsets of miRNAs are dysregulated in disease states such as cancer and how cellular machinery selects and sorts miRNAs into Evs10,11. Given the potential role of EV-miRNAs in modulating the microenvironment, it is critical to identify the mechanisms involved in the export of select miRNAs to fully elucidate the role of EVs in intercellular communication and disease pathogenesis. Understanding the process of miRNA release into EVs will not only highlight important mediators of miRNA export but can also provide insights into potential therapeutics. To achieve this level of knowledge, tools need to be adapted to faithfully address these new experimental questions. Indeed, studies that evaluate EVs are growing exponentially due to the introduction of new techniques and controls12,13. In relation to evaluating the abundance of exported miRNAs into EVs, next-generation sequencing and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) have been the current standard tools. While these tools are useful for evaluating the abundance of miRNAs in EVs, there are limitations to their sensitivity and specificity, and using these static approaches for evaluating dynamics is insufficient. Delineating the dynamics of miRNA export into EVs requires a combination of specialized tools. Here, we present a comprehensive protocol using fluorescently conjugated miRNAs, to analyze the dynamics of miRNA release from donor cells and incorporation into EVs. We also discuss the advantages and limitations of the method and provide recommendations for optimal use. The versatile method presented in this paper will be useful to researchers interested in studying miRNA release into EVs and their potential roles in cellular communication and disease.

Autor destacado: Explorando los mecanismos de carga de microARN en vesículas extracelulares en la progresión del cáncer 

Seguimiento de la liberación de miARN en vesículas extracelulares mediante citometría de flujo

My lab works on studying microRNAs, and we have known for decades that microRNAs are depleted in cancer. However, the mechanism as to how these microRNAs are lost has not been actively understood. Our recent work on extracellular vesicles suggests that microRNA that are depleted in cancer are being actively loaded into these extracellular vesicles.Our goal now is to really get to the mechanism as to how these RNAs are actively loaded into these extracellular vesicles in the process of tumor genesis. The protocol helps understand and capture the dynamic process of microRNAs release into extracellular vesicles, which is one of the challenging areas in studying extracellular vesicle biology. Our findings provide a tool to advance the study of pathways that regulate depletion of microRNAs in cancer.We plan on identifying functional and phenotypic consequences of the loss of specific subsets of microRNA via extracellular vesicles in cancer. Once we identify the factors that are involved in loading these microRNAs into extracellular vesicles, our goal is to down-regulate these factors and evaluate the phenotypic consequence. Moreover, because we identified a motif that's contained in these small RNAs, we're curious to know whether this motif is both necessary and sufficient for loading these RNAs into the extracellular vesicles.

Aquí, utilizamos la citometría de flujo como una herramienta poderosa para investigar la liberación de miARN de las células en las VE. Utilizando este protocolo, el análisis de citometría de flujo de células transfectadas con miRNA celular y miARN EV reveló una disminución secuencial de la señal de fluorescencia correspondiente al miARN EV, mientras que la señal correspondiente al miARN celular se retuvo en las células. Para garantizar que la conjugación de fluoróforos no interfiera con la liberación de mi...

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Aquí, describimos un protocolo sencillo que permite la evaluación in vitro de la abundancia de microARN marcados con fluorescencia para estudiar la dinámica del empaquetamiento y exportación de microARN a vesículas extracelulares (EV).

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle ...

Mi laboratorio trabaja en el estudio de los microARN, y sabemos desde hace décadas que los microARN se agotan en el cáncer. Sin embargo, el mecanismo de cómo se pierden estos microARN no se ha entendido activamente. Nuestro trabajo reciente sobre vesículas extracelulares sugiere que el microARN que se agota en el cáncer se está cargando activamente en estas vesículas extracelulares.Nuestro objetivo ahora es llegar realmente al mecanismo de cómo estos ARN se cargan activamente en estas vesículas extracelulares en el proceso de génesis tumoral. El protocolo ayuda a comprender y capturar el proceso dinámico de liberación de microARN en vesículas extracelulares, que es una de las áreas desafiantes en el estudio de la biología de las vesículas extracelulares. Nuestros hallazgos proporcionan una herramienta para avanzar en el estudio de las vías que regulan el agotamiento de microARN en el cáncer.Planeamos identificar las consecuencias funcionales y fenotípicas de la pérdida de subconjuntos específicos de microARN a través de vesículas extracelulares en el cáncer. Una vez identificados los factores que intervienen en la carga de estos microRNAs en vesículas extracelulares, nuestro objetivo es regular a la baja estos factores y evaluar la consecuencia fenotípica. Además, debido a que identificamos un motivo que está contenido en estos pequeños ARN, tenemos curiosidad por saber si este motivo es necesario y suficiente para cargar estos ARN en las vesículas extracelulares.

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Research

JoVE Journal

Biology

Tracking miRNA Release into Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

1.0K vistas.  Purdue University. Mi laboratorio trabaja en el estudio de los microARN, y sabemos desde hace décadas que los microARN se agotan en el cáncer. Sin embargo, el mecanismo de cómo se pierden estos microARN no se ha entendido activamente. Nuestro trabajo reciente sobre vesículas extracelulares sugiere que el microARN que se agota en el cáncer se está cargando activamente en estas vesículas extracelulares.Nuestro objetivo ahora es llegar realmente al mecanismo de cómo estos ARN se cargan activamente e...

Video: Autor destacado: Explorando los mecanismos de carga de microARN en vesículas extracelulares en la progresión del cáncer 

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle bioactive molecules, including proteins, lipids, and nucleic acids (DNA, mRNAs, microRNAs, and other noncoding RNAs), from one cell to another, leading to phenotypic consequences in the recipient cells. Of all the various EV cargo, microRNAs (miRNAs) have garnered a great deal of attention for their role in shaping the microenvironment and in educating recipient cells because of their clear dysregulation and abundance in EVs. Additional data indicates that many miRNAs are actively loaded into EVs. Despite this clear evidence, research on the dynamics of export and mechanisms of miRNA sorting is limited. Here, we provide a protocol using flow cytometry analysis of EV-miRNA that can be used to understand the dynamics of EV-miRNA loading and identify the machinery involved in miRNA export. In this protocol, miRNAs predetermined to be enriched in EVs and depleted from donor cells are conjugated to a fluorophore and transfected into the donor cells. The fluorescently tagged miRNAs are then verified for loading into EVs and depletion from cells using qRT-PCR. As both a transfection control and a tool for gating the transfected population of cells, a fluorescently labeled cellular RNA (cell-retained and EV-depleted) is included. Cells transfected with both the EV-miRNA and cell-retained-miRNA are evaluated for fluorescent signals over the course of 72 h. The fluorescence signal intensity specific for the EV-miRNAs diminishes rapidly compared to the cell-retained miRNA. Using this straightforward protocol, one could now assess the dynamics of miRNA loading and identify various factors responsible for loading miRNAs into EVs.

Here, we describe a straightforward protocol that enables in vitro assessment of the abundance of fluorescently labeled microRNAs to study the dynamics of microRNA packaging and export into extracellular vesicles (EVs).

Investigación

Biología

Flow Cytometry Analysis of Cell-miRNA and EV-miRNA Signal in Calu6 Cells Transfected with Fluorophore-Conjugated EV-miRNA

Flow Cytometry Analysis of Cell-miRNA and EV-miRNA Signal in Calu6 Cells Transfected with Fluorophore-Conjugated EV-miRNA(Video) 

To begin, take Calu6 cells transfected with fluorophore-conjugated EV-microRNA and cell-microRNA. Filter the cell suspension through a 35 micrometer strainer cap included with the round bottom polystyrene FACS tubes. Then set up the flow cytometry instrument, switch on the flow cytometer, and allow it to warm up for 30 minutes before use.Prime the fluidic system with sheath fluid. After that, verify and adjust the laser alignment. For quality control, load ultrapure filtered water into the flow cytometer and run it at an appropriate flow rate, ensuring an adequate acquisition time.Then set the threshold for capturing the signal from Calu6 cells at FSC 5, 000. To account for spectral overlap between fluorophores, prepare compensation controls using untransfected cells and cells transfected with only one fluorophore. Perform expression analysis in transfected cells using the FSC, SSC, FITC, and PE channels set at 258, 192, 269, and 423 voltage units respectively.Then introduce the negative control sample into the flow cytometer. Capture cell signals after defining FSC and SSC intensities in a custom worksheet. Select FSC for the X-axis and SSC for the Y axis in the plot.Draw a polygon around the population of interest to create a gate on the axis. To create a new plot using the gated population, set the X-axis to fluorescent signal 1. For cell-microRNA detection and the Y-axis to fluorescent signal 2 for EV-microRNA detection.Establish compensation parameters for the individual fluorophores using cells independently transfected with each of the fluorescently tagged microRNAs. Flow cytometry analysis of cells transfected with cell-microRNA and EV-microRNA revealed a sequential decrease of fluorescence signal corresponding to EV-microRNA. In contrast, the signal corresponding to the cell-microRNA was retained in the cells, indicating that the fluorophore does not impact the retention of microRNAs by the cells.

Análisis por citometría de flujo de la señal de miARN celular y miARN EV en células Calu6 transfectadas con miARN EV conjugado con fluoróforos

Flow Cytometry Analysis of Cell-miRNA and EV-miRNA Signal in EVs Isolated from Calu6 Cells Transfected with Fluorophore-Conjugated EV-miRNA

To begin, take EVs isolated from Calu6 cells, transfected with fluorophore-conjugated EV-micro RNA, and cell-micro RNA. Dilute the EVs in an appropriate volume of ultra-filtered PBS to prepare the extracellular vesicle suspension for flow cytometry analysis. Use the nano-flow cytometer to analyze nano-sized particles.Launch the software and configure the instrument according to the recommended calibration instructions. Using performance nano-beads, conduct the performance test. The instrument's performance is deemed optimal if the nano-beads are detected within the standard size range.Determine the suitable flow rate for EV particle detection. Now, perform a quality control check using ultrapure filtered water to verify the instruments fluidics and assess the performance of detectors and lasers. Configure the parameters to evaluate the sensitivity and resolution of different populations in the bead mix as per the manufacturer's protocol.Then, apply appropriate gating to distinguish the bead population from instrument noise. Next, thoroughly vortex the samples to ensure the even distribution of EVs before loading them for analysis. Launch the flow cytometry data analysis software and introduce ultra-filtered PBS.Using ultra-filtered PBS, set up gating for EV particles ensuring that the gating corresponds to the appropriate size of particles based on the calibration. Take EVs that have been transferred and vortexed in an attuned compatible tube and load the tube into the instrument. Capture EV signals while plotting FSC on the x-axis and SSC on the y-axis.For cell micro RNA detection on the x-axis, select fluorescence signal 1, and for EV micro RNA detection on the y-axis, choose fluorescence signal 2. Using the EV samples isolated from cells transfected with a single micro RNA. Established compensation parameters for the fluorophores.Flow cytometry revealed a time dependent accumulation of miR-451a, Alexa fluor-488 in EVs supporting efficient packaging and release. In contrast, the fluorescence of cell miR-67 was not observed in EVs.

Análisis de citometría de flujo de la señal de miARN celular y miARN EV en VE aisladas de células Calu6 transfectadas con miARN EV conjugado con fluoróforos