Para empezar, tome VE aisladas de células Calu6, transfectadas con micro ARN EV conjugado con fluoróforos y micro ARN célula. Diluir los VE en un volumen adecuado de PBS ultrafiltrado para preparar la suspensión de vesículas extracelulares para el análisis por citometría de flujo. Utilice el citómetro de nanoflujo para analizar partículas de tamaño nanométrico.
Inicie el software y configure el instrumento de acuerdo con las instrucciones de calibración recomendadas. Usando nanoperlas de rendimiento, realice la prueba de rendimiento. El rendimiento del instrumento se considera óptimo si las nanoperlas se detectan dentro del rango de tamaño estándar.
Determine el caudal adecuado para la detección de partículas EV. Ahora, realice un control de calidad utilizando agua filtrada ultrapura para verificar la fluídica de los instrumentos y evaluar el rendimiento de los detectores y láseres. Configure los parámetros para evaluar la sensibilidad y la resolución de diferentes poblaciones en la mezcla de perlas según el protocolo del fabricante.
A continuación, aplique la compuerta adecuada para distinguir la población de cuentas del ruido del instrumento. A continuación, vórtese minuciosamente las muestras para garantizar la distribución uniforme de los vehículos eléctricos antes de cargarlos para su análisis. Inicie el software de análisis de datos de citometría de flujo e introduzca el PBS ultrafiltrado.
Utilizando PBS ultrafiltrado, configure la compuerta para las partículas EV asegurándose de que la compuerta corresponda al tamaño adecuado de partículas en función de la calibración. Tome los EV que han sido transferidos y vertiginosos en un tubo compatible sintonizado y cargue el tubo en el instrumento. Capture las señales EV mientras traza FSC en el eje x y SSC en el eje y.
Para la detección de micro ARN celular en el eje x, seleccione la señal de fluorescencia 1, y para la detección de micro ARN EV en el eje y, elija la señal de fluorescencia 2. Utilizando las muestras de EV aisladas de células transfectadas con un solo micro ARN. Parámetros de compensación establecidos para los fluoróforos.
La citometría de flujo reveló una acumulación dependiente del tiempo de miR-451a, Alexa fluor-488 en vehículos eléctricos que respaldan un empaquetado y lanzamiento eficientes. Por el contrario, la fluorescencia de la célula miR-67 no se observó en los EV.
