Realizar el protocolo dentro de una cabina de bioseguridad en el ratón eutanasiado debidamente afeitado y desinfectado con etanol al 70%. Cree una incisión superficial de 0.5 pulgadas en el abdomen del animal con unas tijeras. Corte longitudinalmente a lo largo de la línea media hacia el cuello y la parte inferior del abdomen.
Además, haz cortes laterales para abrir la piel. Con pinzas romas, separe suavemente la piel de los tejidos circundantes, mientras rodea el torso del animal cortando la piel lateralmente alrededor del cuello y la parte inferior del abdomen. Coloque cuidadosamente la piel con el lado de la dermis hacia abajo en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros.
Y asegúrese de que la piel esté lo más estirada posible. Agregue seis mililitros de solución de Dispasa a la placa, asegurándose de que la piel esté completamente cubierta. Luego, cubre el plato.
Envuelva el plato con Parafilm. Incuba la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos para aplanar el explante. Al día siguiente, con una pipeta, retire el líquido de la placa que contiene la piel aislada.
Luego, con la ayuda de fórceps, separe la dermis de la epidermis mientras elimina cualquier tejido adiposo visible de ella. Y coloque la dermis aislada en una placa de cultivo de tejido limpio. Añada un mililitro de DMEM que contenga 1X solución antibiótica-antimicótica a la dermis en la placa de cultivo.
Incline el plato para acumular el líquido en un lado del plato. Luego, pica la dermis en trozos de uno a dos milímetros cuadrados. Y transfiéralos a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.
Agregue 10 mililitros de solución de colagenasa tipo II al tubo. Incubar durante dos horas a 37 grados centígrados con agitación continua a 30 a 50 rpm para digerir la dermis. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micras.
Y centrifugarlo a 250 g durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 milímetros de DMEM que contenga una solución antibiótica-antimicótica. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micras antes de centrifugar, como se demostró anteriormente.
Vuelva a suspender el pellet celular resultante en un mililitro de medio LEC completo. A continuación, coloque las células en medios LEC completos en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros recubierta de colágeno. Reemplace el medio cada dos días lavando las celdas con PBS dos veces y agregando medios LEC nuevos.
Las imágenes de bajo aumento de las células aisladas de la dermis murina mostraron una población celular mixta.
