Purificación de células endoteliales linfáticas murinas

Para purificar las células endoteliales linfáticas de la orina, use células aisladas de la dermis murina después de que alcancen aproximadamente el 80 al 90% de cofluidez, comience lavando las perlas magnéticas precodificadas en un separador magnético usando un mililitro de solución de recubrimiento de perlas magnéticas. Vuelva a suspender las perlas en 150 microlitros de DMEM que contengan 0,1% de BSA. A continuación, lave las células de la placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros dos veces con PBS.

Mezclar 50 microlitros de las perlas conjugadas de anticuerpos con tres mililitros de DMEM que contengan 0,1%BSA y añadirlo a las células. Selle el plato con biopelícula, luego incube el plato en una coctelera agitando a 10 RPM a temperatura ambiente durante exactamente 10 minutos. Deseche el medio antes de lavar las celdas una vez con PBS.

Inspeccione rápidamente las celdas para verificar la presencia de colonias de LEC en la placa. Añadir un mililitro de tripsina EDTA a las células e incubar durante tres minutos a 37 grados centígrados para tripsinizar las células. Inspeccione las celdas para ver si se han desacoplado correctamente.

Después de neutralizar la solución con dos mililitros de medio LEC completo. Transfiera la solución celular a un tubo de polipropileno estéril de cinco mililitros. Usando un separador magnético, lave las células con tres mililitros de DMEM que contengan 0.1% de BSA para eliminar las células no unidas.

Vuelva a suspender las células restantes unidas a las perlas en medios LEC completos y colóquelas en placas de cultivo de tejidos de 60 milímetros recubiertas de colágeno. Las imágenes de campo claro y fluorescencia identificaron fácilmente las células endoteliales linfáticas positivas para LYVE1 después de la purificación y mostraron varias perlas adheridas a ellas. Las células mostraron baja confluencia 24 horas después de la purificación, mientras que fueron altamente cofluentes, siete días después de la purificación.