Reacciones de expresión libre de células a granel con pequeñas vesículas unilaminares (SUV) para aplicaciones de células sintéticas

Para comenzar, sople un suave chorro de Argonne en un frasco de vidrio que contenga lípidos POPC mientras gira suavemente el vial. Cuando los lípidos se hayan secado como una película en el fondo del vial, tápalo sin apretar y luego transfiéralo a un desecador. Después de una hora, agregue 0,5 mililitros de agua desionizada ultrapura para disolver la película lipídica.

Agite la solución durante dos minutos. A continuación, remoje dos soportes de filtro y agua desionizada. Colócalos en cada uno de los soportes de la membrana interna.

A continuación, coloque un filtro de policarbonato de 100 nanómetros entre los dos soportes de membrana interna, unidos por la carcasa exterior del extrusor y la tuerca de retención. Coloque la configuración en el soporte del extrusor para terminar de configurar el mini aparato de extrusión. A continuación, cargue la mezcla de agua lipídica en una jeringa apretada de un mililitro.

Use clips de brazo oscilante para asegurar la jeringa en un extremo del mini extrusor. Inserte la segunda jeringa en el otro extremo del mini extrusor, asegurándose de que esté completamente presionada. Ahora pase la mezcla de agua lipídica de la jeringa original a la vacía a través del aparato.

Después de repetir la extrusión 11 veces, transfiera los SUV a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para ensamblar el protocolo de expresión libre de células, pipetee soluciones de uno a 3 plásmidos de ADN que codifican para SFGFP soluble o variantes de SFGFP de receptor de glutamato, ARNasa murina y solución de SUV en un vial. Agregue agua desionizada ultrapura para llevar el volumen de reacción a 20 microlitros.

Transfiera la solución de expresión libre de células a una placa inferior cónica en V de 96 pocillos. Incubar la placa en un lector de placas a 37 grados centígrados durante cuatro o cinco horas. Configure el lector de placas con una ganancia de 100, una excitación de 485 nanómetros, una emisión de 528 nanómetros, un tiempo de ejecución de cinco horas y una medición a intervalos de una lectura por cada dos minutos.

Mida la señal GFP cada dos minutos para monitorear la reacción libre de células en tiempo real. El SFGFP soluble tuvo la expresión más alta entre las tres proteínas.