APL agradece el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (EF1935265), los Institutos Nacionales de Salud (R01-EB030031 y R21-AR080363) y la Oficina de Investigación del Ejército (80523-BB)

Los reactivos y equipos utilizados para este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Reacciones masivas de CFE en presencia de pequeñas vesículas unilaminares (SUV)
<ol><li>Preparación para SUV NOTA: Este paso debe realizarse en una campana extractora siguiendo las instrucciones de seguridad para trabajar con cloroformo.<ol><li>Prepare 5 mM de SUV de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) en un vial de vidrio transfiriendo 76 μL de solución madre de POPC de 25 mg/mL disuelta en cloroformo.</li>
		<li>Mientras gira suavemente el vial de vidrio, sople un suave chorro de argón en el vial para formar una película de lípidos secos en el fondo. A continuación, transfiera el frasco de vidrio a un desecador con la tapa sin enroscar para evaporar el exceso de cloroformo.</li>
		<li>Mantenga el vial de vidrio en el desecador durante 1 h. A continuación, añada 0,5 ml de agua desionizada ultrapura para disolver la película lipídica y el vórtice durante aproximadamente 2 minutos.</li>
		<li>Configure un mini aparato de extrusión sumergiendo dos soportes de filtro en agua desionizada y colocándolos en cada uno de los soportes de membrana interna. A continuación, empapa un filtro de policarbonato de 100 nm y colócalo entre los dos soportes de membrana interna unidos por la carcasa exterior del extrusor y la tuerca de retención. Coloque esta configuración en el soporte del extrusor.</li>
		<li>Enjuague dos jeringas herméticas al gas de 1 ml 3 veces con agua desionizada ultrapura.</li>
		<li>Cargue la muestra de mezcla de lípidos y agua en una de las jeringas herméticas a gas de 1 ml y colóquela en un extremo del mini extrusor utilizando los clips del brazo oscilante para mantener la jeringa en su lugar. Inserte la segunda jeringa en el otro extremo del miniextrusor y asegúrese de que esté completamente presionada. NOTA: Cuando cargue la jeringa con la mezcla de lípidos y agua, asegúrese de que no haya aire en la jeringa antes de pasarla a través de la miniextrusora.</li>
		<li>Pase suavemente la mezcla de lípidos y agua de la jeringa original a la jeringa vacía a través del aparato miniextrusor. Repita este paso 11 veces para formar SUV. Transfiera los SUV a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: La solución para SUV puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Conjunto de reacción CFE<ol><li>Ensamble la reacción CFE siguiendo el protocolo de expresión libre de células proporcionado por el fabricante con ligeras modificaciones que se detallan a continuación.</li>
		<li>Mezclar 10 μL de Solución 1 (que contiene aminoácidos, NTPs, ARNt y sustratos para enzimas, y el tampón necesario), 1 μL de Solución 2 (proteínas en glicerol al 20%), 2 μL de Solución 3 (ribosoma (20 μM)), cantidad adecuada de ADN que codifica para sfGFP-sfCherry(1-10)27 soluble (referido sfGFP soluble en adelante), WT-GluR0-sfGFP o PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 pares de bases), 1 μL de inhibidor de la ARNasa murina y 4 μL de solución SUV de 5 mM para proteínas de membrana o 4 μL de agua para proteínas solubles.</li>
		<li>Lleve el volumen final de la reacción a 20 μL añadiendo agua desionizada ultrapura. NOTA: Al ensamblar el sistema CFE, todos los componentes deben mantenerse en hielo. Todos los materiales son sensibles a la temperatura y pueden degradarse si alcanzan la temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubación y monitoreo de reacciones de CFE<ol><li>Transfiera la solución de CFE a una placa cónica de fondo en V de 96 pocillos. Para evitar la evaporación durante el curso de la reacción, cubra la placa con una película de sellado.</li>
		<li>Cocine la placa a 37 °C en un lector de placas durante 4-5 h mientras supervisa la reacción CFE midiendo la señal GFP con una ganancia de 100 a longitudes de onda de excitación/emisión de 488 nm/528 nm cada 2 minutos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reacciones de CFE encapsuladas en GUVs
<ol><li>Preparación de la solución tampón externa GUV<ol><li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, mezcle 1,5 μL de 1 M de espermidina, 37,5 μL de 100 mM de ATP, 25 μL de 100 mM de GTP, 12,5 μL de 100 mM de CTP, 12,5 μL de 100 mM de UTP, 25 μL de fosfato de creatina 1 M, 18 μL de acetato de magnesio 1 M, 93,33 μL de glutamato de potasio 3 M, 50 μL de 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL de ácido folínico 332 mM, 100 μL de glucosa 2 M y 50 μL de solución madre de mezcla de 6 mM de cada uno de los 20 aminoácidos (preparados siguiendo el protocolo descrito por Sun et al.28).</li>
		<li>Lleve el volumen final de la solución a 1 mL agregando agua desionizada ultrapurificada. NOTA: Todos los componentes deben mantenerse en hielo. Agregue la mezcla de aminoácidos al final para evitar el agotamiento de aminoácidos28. La solución puede alícuota en alícuotas de 330 μL y almacenarse a -20 °C hasta su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la mezcla de lípidos en aceite NOTA: este paso debe realizarse en una campana extractora siguiendo las instrucciones de seguridad para trabajar con cloroformo.<ol><li>En una campana extractora, mezcle 17,3 μL de 25 mg/mL de solución madre POPC y 1,08 μL de 50 mg/mL de copolímero de poli(butadieno)-b-poli(óxido de etileno) (PEO-b-PBD) en un vial de vidrio de 15 mL. NOTA: La solución final de lípidos en aceite contiene 0,5 mM de lípidos con 95% y 5% de POPC y PEO-b-PBD, respectivamente. El PEO-b-PBD se utilizó para mejorar la estabilidad de la membrana durante la expresión de proteínas, pero se mantuvo en una proporción molar baja para reducir la tendencia del copolímero a agregarse en micelas separadas de las moléculas lipídicas29,30.</li>
		<li>Sople con cuidado un suave chorro de gas argón en el vial de vidrio mientras gira el vial para evaporar el cloroformo.</li>
		<li>Pipetear 1,2 mL de aceite mineral ligero en el vial de vidrio de 15 mL que contiene los lípidos secos.</li>
		<li>Mezclar los lípidos y el aceite mediante vórtice a velocidad máxima durante 10-20 s. La mezcla de lípidos y copolímeros disueltos tendrá un aspecto turbio.</li>
		<li>Para asegurarse de que todos los posibles agregados lipídicos en el aceite se disuelvan y dispersen completamente por todo el aceite, coloque el vial de vidrio en un horno a unos 50 °C durante 20 minutos antes de vórtice durante 10-20 s adicionales a velocidad máxima.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensamblaje y encapsulación de la reacción CFE (la Figura 1 resume los siguientes pasos).<ol><li>Prepare 300 μL de la solución externa de GUV en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL mezclando 270 μL de solución tampón externa de CFE preparada en el paso 2.1, 15 μL de 5 M de NaCl y 15 μL de 4,5 M de KCl. NOTA: En este paso, agregue 0,45 μL de 1,4-ditiotritol (DTT) de 1 M a la solución externa de GUV. El propósito de agregar NaCl y KCl es ajustar la osmolalidad de la solución externa para que coincida con la solución CFE interna. El volumen exacto de NaCl y KCl depende del ajuste de osmolalidad deseado. Se puede añadir NaCl o KCl o ambos para ajustar la osmolalidad.</li>
		<li>Pipetear suavemente 300 μL de mezcla de lípidos en aceite sobre la solución externa de GUV. NOTA: Al agregar la mezcla de lípidos y aceite, es importante que el aceite no se mezcle con la solución externa acuosa. Después de la adición, debe haber una interfaz visible entre la mezcla de lípidos en aceite y la solución externa de GUV.</li>
		<li>Incubar la interfaz aceite-agua a temperatura ambiente durante 2 h para permitir que se forme la monocapa lipídica y se estabilice en la interfaz.</li>
		<li>Mientras tanto, siga la sección 1.2.1 para ensamblar una reacción CFE que contenga el ADN plásmido que codifica las variantes de proteínas de membrana o GFP soluble. Reemplace los 4 μL de solución SUV de 5 mM o el agua con 4 μL de sacarosa 1 M. Esta reacción será la solución interna de GUV. NOTA: Se utilizó un osmómetro para medir la osmolalidad de las soluciones internas y externas. A continuación, la osmolalidad de la solución exterior se ajustó en consecuencia mediante la adición de NaCl o agua. La osmolalidad de la reacción CFE suele ser de alrededor de 1600 mOsm/Kg. La adición de sacarosa a la reacción aumenta la densidad de la solución interna, permitiendo así que las vesículas viajen a través de la interfaz aceite-agua durante la etapa de centrifugación. Una alternativa a la sacarosa es la solución de gradiente de densidad Opti-Prep.</li>
		<li>Agregue 600 μL de mezcla de lípidos y aceite al tubo de microcentrífuga que contiene la reacción CFE y pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante ~ 1 minuto para emulsionar la reacción en solución de lípidos en aceite y formar la monocapa de lípidos alrededor de las células sintéticas. NOTA: La solución final no debe tener burbujas y debe tener un aspecto opaco.</li>
		<li>Pipetear suavemente la emulsión de solución interna sobre la capa de aceite en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml donde se instaló la interfaz aceite-agua. NOTA: Tenga cuidado de no perturbar o desestabilizar la interfaz.</li>
		<li>Centrifugar durante 10 min a 2.000 x g a 4 °C. NOTA: La velocidad de centrifugación se optimizó para este protocolo. Adir et al.31 reportaron una velocidad de centrifugación diferente.</li>
		<li>Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado el exceso de aceite y la solución exterior del tubo de microcentrífuga con una pipeta. Retire la solución exterior hasta que el volumen restante sea de alrededor de 100 μL. NOTA: Un pellet de GUV suele ser visible en la parte inferior del tubo de la microcentrífuga. Sin embargo, la falta de un pellet visible no significa necesariamente que no haya rendimiento de GUV. En lugar de usar una pipeta, el exceso de aceite en la parte superior de la solución exterior se puede eliminar por aspiración. Es fundamental asegurarse de que la solución de lípidos en aceite se elimine por completo. La contaminación del aceite en la solución GUV puede causar imágenes de baja calidad.</li>
		<li>Vuelva a suspender el gránulo de GUV en la solución restante de 100 μl pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, transfiera la solución GUV a una placa de fondo plano limpia de 96 pozos para incubar.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Incubación e imagen encapsuladas de la reacción CFE
<ol><li>Cubra la placa con una película de sellado para evitar la evaporación. Incubar la placa a 37 °C durante 5-6 h. Se puede utilizar un lector de placas y seguir el paso 1.3.2 para preparar el lector de placas para la etapa de incubación.</li>
	<li>Una vez finalizada la incubación, coloque la placa de 96 pocillos en la platina de imagen de un microscopio invertido equipado con una cámara EMCCD (o una cámara sCMOS), un láser controlado por DAQ-MX (o un sistema combinado de láser integrado) y un disco giratorio CSU-X1 confocal (o un confocal de escaneo láser). Concéntrese en cualquier ROI que contenga GUV y capture imágenes a una longitud de onda de excitación de 488 nm utilizando un objetivo Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.</li>
	<li>Guarde imágenes de GUV en formato .tiff.</li>
	<li>Abra las imágenes en un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ o Fiji). Abra el panel de configuración de Brillo/Contraste . Ajuste el brillo y el contraste a la configuración adecuada que haga visibles las proteínas fluorescentes.</li>
	<li>Si el objetivo es comparar la intensidad de la señal de diferentes proteínas expresadas, primero apile imágenes individuales de GUV que contengan diferentes proteínas utilizando el panel Imágenes para apilar ubicado en el submenú Imagen > Pilas . A continuación, ajusta el brillo y el contraste de todas las imágenes con el panel Brillo/Contraste .</li>
</ol>

Expresión libre de células de proteínas de membrana en vesículas unilamelares gigantes

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. 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A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+recruitment+of+ribosomes+in+protocells+recreates+a+translocon-independent+mechanism+of+proteorhodopsin+biogenesis.">Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis.</a> iScience. 24 (5), 102429 (2021).</li><li>Steink&#252;her, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+expression+of+membrane+proteins+by+tuning+ribosome+cotranslational+membrane+association+and+nascent+chain+aggregation.">Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+conjugation+of+(tri-)+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems.">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li><li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts,+liposomes+and+emulsion+transfer.">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829 (2020).</li><li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Prácticamente cualquier proceso celular que dependa de la transferencia de moléculas o información a través de la membrana celular, como la señalización celular o la excitación celular, requiere proteínas de membrana. Por lo tanto, la reconstitución de proteínas de membrana se ha convertido en el principal cuello de botella en la realización de varios diseños de células sintéticas para diferentes aplicaciones. La reconstitución tradicional mediada por detergentes de proteínas de membrana en membranas biol...

La biología sintética ascendente ha ganado un interés creciente en la última década como un campo emergente con numerosas aplicaciones potenciales en bioingeniería, administración de fármacos y medicina regenerativa 1,2. El desarrollo de células sintéticas como piedra angular de la biología sintética ascendente, en particular, ha atraído a una amplia gama de comunidades científicas debido a las prometedoras aplicaciones de las células sintéticas, así como a sus propiedades físicas y bioquímicas similares a las de las células que facilitan los estudios biofísicos in vitro 3,4,5,6 . Las células sintéticas a menudo se diseñan en vesículas unilaminares gigantes (GUV) del tamaño de una célula en las que se recrean diferentes procesos biológicos. La reconstitución del citoesqueleto celular 7,8, la regeneración de energía dependiente de la luz9, la comunicación celular10,11 y la biodetección12 son ejemplos de los esfuerzos realizados para reconstruir comportamientos similares a los de las células en células sintéticas.
Si bien algunos procesos celulares dependen de proteínas solubles, muchas características de las células naturales, como la detección y la comunicación, a menudo utilizan proteínas de membrana, incluidos canales iónicos, receptores y transportadores. Un desafío importante en el desarrollo de células sintéticas es la reconstitución de las proteínas de membrana. Aunque los métodos tradicionales de reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas se basan en la purificación mediada por detergentes, estos métodos son laboriosos, ineficaces para proteínas que son tóxicas para el huésped de expresión o, a menudo, no son adecuados para la reconstitución de proteínas de membrana en GUV13.
Un método alternativo para la expresión de proteínas son los sistemas de expresión libre de células (CFE). Los sistemas CFE han sido una poderosa herramienta en biología sintética que permite la expresión in vitro de diversas proteínas utilizando lisado celular o maquinaria de transcripción-traducción purificada14. Los sistemas CFE también pueden encapsularse en GUVs, permitiendo así reacciones de síntesis de proteínas compartimentadas que pueden programarse para diversas aplicaciones, como la creación de células sintéticas de captación de luz9 o biosensores mecanosensibles15,16. De manera análoga a los métodos de expresión de proteínas recombinantes, la expresión de proteínas de membrana es un desafío en los sistemas CFE17. La agregación, el plegamiento incorrecto y la falta de modificación postraduccional en los sistemas CFE son cuellos de botella importantes que dificultan la síntesis exitosa de proteínas de membrana utilizando sistemas CFE. La dificultad de la reconstitución de proteínas de membrana de abajo hacia arriba utilizando sistemas CFE se debe en parte a la ausencia de una vía compleja de biogénesis de proteínas de membrana que se base en péptidos señal, partículas de reconocimiento de señales, translocones y moléculas acompañantes. Sin embargo, recientemente, múltiples estudios han sugerido que la presencia de estructuras membranosas como microsomas o liposomas durante la traducción promueve la expresión exitosa de proteínas de membrana 18,19,20,21. Además, Eaglesfield et al. y Steinküher et al. han descubierto que la inclusión de dominios hidrofóbicos específicos conocidos como péptidos señal en el extremo N-terminal de la proteína de membrana puede mejorar significativamente su expresión22,23. En conjunto, estos estudios sugieren que el desafío de la reconstitución de proteínas de membrana en células sintéticas puede superarse si la traducción de proteínas se produce en presencia de la membrana GUV y si se utiliza el péptido señal N-terminal adecuado.
En este trabajo se presenta un protocolo para la encapsulación de la síntesis de proteínas utilizando reacciones CFE de elementos recombinantes (PURE) para la reconstitución de proteínas de membrana en GUVs. Se selecciona el receptor bacteriano de glutamato24 (GluR0) como proteína modelo de membrana y se estudia el efecto de su péptido señal N-terminal en la reconstitución de su membrana. Se investiga el efecto del péptido señal de proteorrodopsina, que Eaglesfield et al.22 demostraron mejorar la eficiencia de la reconstitución de proteínas de membrana, mediante la construcción de una variante mutada de GluR0 denominada PRSP-GluR0 y se compara su expresión y localización en la membrana con GluR0 de tipo salvaje (en adelante, WT-GluR0) que alberga su péptido señal nativo. Este protocolo se basa en el método de emulsión invertida25 con modificaciones que lo hacen robusto para la encapsulación de CFE. En el método presentado, las reacciones de CFE se emulsionan primero utilizando una solución de lípidos en aceite que genera gotas del tamaño de una micra que contienen el sistema CFE y son estabilizadas por la monocapa de lípidos. A continuación, las gotas de emulsión se colocan sobre una interfaz aceite-agua que está saturada con otra monocapa lipídica. A continuación, las gotas de emulsión se ven obligadas a viajar a través de la interfaz aceite-agua mediante la fuerza centrífuga. A través de este proceso, las gotas obtienen otra monocapa, generando así una vesícula lipídica bicapa. A continuación, se incuban los GUV que contienen la reacción CFE, durante la cual se expresa la proteína de membrana y se incorpora a la membrana GUV. Aunque este protocolo está especificado para la expresión libre de células de GluR0, puede utilizarse para la síntesis libre de células de otras proteínas de membrana o para diferentes aplicaciones de células sintéticas, como la reconstitución de citoesqueletos o los estudios de fusión de membranas26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

Los sistemas de expresión libre de células (CFE) son herramientas poderosas en biología sintética que permiten la biomímesis de funciones celulares como la biodetección y la regeneración de energía en células sintéticas. Sin embargo, la reconstrucción de una amplia gama de procesos celulares requiere la reconstitución exitosa de las proteínas de membrana en la membrana de las células sintéticas. Si bien la expresión de proteínas solubles suele tener éxito en los sistemas CFE comunes, la reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas de células sintéticas ha demostrado ser un desafío. Aquí, se demuestra un método para la reconstitución de una proteína de membrana modelo, el receptor bacteriano de glutamato (GluR0), en vesículas unilaminares gigantes (GUVs) como células sintéticas modelo basado en la encapsulación e incubación de la reacción CFE dentro de células sintéticas. Utilizando esta plataforma, se demuestra el efecto de la sustitución del péptido señal N-terminal de GluR0 por el péptido señal de proteorrodopsina en la translocación cotraduccional exitosa de GluR0 en membranas de GUV híbridos. Este método proporciona un procedimiento robusto que permitirá la reconstitución libre de células de varias proteínas de membrana en células sintéticas.

Bottom-up synthetic biology has gained increasing interest over the past decade as an emerging field with numerous potential applications in bioengineering, drug delivery, and regenerative medicine1,2. The development of synthetic cells as a cornerstone of bottom-up synthetic biology, in particular, has attracted a wide range of scientific communities due to the promising applications of synthetic cells as well as their cell-like physical and biochemical properties that facilitate in vitro biophysical studies3,4,5,6. Synthetic cells are often engineered in cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) in which different biological processes are recreated. Reconstitution of cell cytoskeleton7,8, light-dependent energy regeneration9, cellular communication10,11, and biosensing12 are examples of efforts made to reconstruct cell-like behaviors in synthetic cells.
While some cellular processes rely on soluble proteins, many characteristics of natural cells, such as sensing and communication, often utilize membrane proteins, including ion channels, receptors, and transporters. A major challenge in synthetic cell development is the reconstitution of membrane proteins. Although traditional methods of membrane protein reconstitution in lipid bilayers rely on detergent-mediated purification, such methods are laborious, ineffective for proteins that are toxic to the expression host, or are often not suited for membrane protein reconstitution in GUVs13.
An alternative method for protein expression is cell-free expression (CFE) systems. CFE systems have been a powerful tool in synthetic biology that allows in vitro expression of various proteins using either cell lysate or purified transcription-translation machinery14. CFE systems can also be encapsulated in GUVs, thus allowing compartmentalized protein synthesis reactions that can be programmed for various applications, such as the creation of light-harvesting synthetic cells9 or mechanosensitive biosensors15,16. Analogous to recombinant protein expression methods, membrane protein expression is challenging in CFE systems17. Aggregation, misfolding, and lack of post-translational modification in CFE systems are major bottlenecks that hinder successful membrane protein synthesis using CFE systems. The difficulty of bottom-up membrane protein reconstitution using CFE systems is due in part to the absence of a complex membrane protein biogenesis pathway that relies on signal peptides, signal recognition particles, translocons, and chaperoning molecules. However, recently, multiple studies have suggested that the presence of membranous structures such as microsomes or liposomes during translation promotes successful membrane protein expression18,19,20,21. Additionally, Eaglesfield et al. and Steink&#252;her et al. have found that the inclusion of specific hydrophobic domains known as signal peptides in the N-terminus of the membrane protein can significantly improve its expression22,23. Altogether, these studies suggest that the challenge of membrane protein reconstitution in synthetic cells can be overcome if the protein translation occurs in the presence of the GUV membrane and if proper N-terminal signal peptide is utilized.
Here, a protocol for encapsulation of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) CFE reactions for membrane protein reconstitution in GUVs is presented. Bacterial glutamate receptor24 (GluR0) is selected as the model membrane protein, and the effect of its N-terminal signal peptide on its membrane reconstitution is studied. The effect of proteorhodopsin signal peptide, which was shown to improve membrane protein reconstitution efficiency by Eaglesfield et al.22, is investigated by constructing a mutated variant of GluR0 denoted as PRSP-GluR0 and its expression and membrane localization with wild-type GluR0 (referred to as WT-GluR0 hereafter) that harbors its native signal peptide is compared. This protocol is based on the inverted emulsion method25 with modifications that make it robust for CFE encapsulation. In the presented method, the CFE reactions are first emulsified using a lipid-in-oil solution that generates micron-sized droplets that contain the CFE system and are stabilized by the lipid monolayer. The emulsion droplets are then layered on top of an oil-water interface that is saturated with another lipid monolayer. The emulsion droplets are then forced to travel across the oil-water interface via centrifugal force. Through this process, the droplets obtain another monolayer, thus generating a bilayer lipid vesicle. The GUVs containing the CFE reaction are then incubated, during which the membrane protein is expressed and incorporated into the GUV membrane. Although this protocol is specified for cell-free expression of GluR0, it can be used for cell-free synthesis of other membrane proteins or different synthetic cell applications such as cytoskeleton reconstitution or membrane fusion studies26.

Autor destacado: Reconstitución de proteínas de membrana en células sintéticas

Reconstitución del canal receptor de glutamato bacteriano mediante encapsulación de un sistema de expresión libre de células

Our protocol addresses the reconstitution of a membrane protein within the lipid bilayer of a synthetic cell made using the inverted droplet emulsion method. The advantage of using the inverted droplet emulsion method is its ability to generate synthetic cells that provide a stable environment for the cell-free expression of membrane proteins. Our protocol offers a robust method for researchers in the field to synthesize membrane proteins inside synthetic cells using cell-free expression system.My lab is working on reconstituting various ion channels in synthetic cells through the reconstitution of the action potential by a well-defined set of ion channels.

Antes de la encapsulación de las reacciones CFE, dos variantes de GluR0-sfGFP que albergaban péptidos señal nativos y proteorrodopsina (las secuencias de péptidos señal se presentan en la Tabla Suplementaria 1), y el sfGFP soluble se expresaron individualmente en reacciones masivas, y su expresión se monitoreó mediante la detección de la señal de sfGFP utilizando un lector de placas (Figura 2A). Las proteínas de membrana se expresaron en ausencia o...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Protein Reconstitution in Synthetic Cells at JoVE.com

Este protocolo describe el método de emulsión invertida utilizado para encapsular un sistema de expresión libre de células (CFE) dentro de una vesícula unilaminar gigante (GUV) para la investigación de la síntesis e incorporación de una proteína de membrana modelo en la bicapa lipídica.

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Nuestro protocolo aborda la reconstitución de una proteína de membrana dentro de la bicapa lipídica de una célula sintética elaborada mediante el método de emulsión de gota invertida. La ventaja de utilizar el método de emulsión de gotas invertidas es su capacidad para generar células sintéticas que proporcionan un entorno estable para la expresión libre de células de proteínas de membrana. Nuestro protocolo ofrece un método robusto para que los investigadores en el campo sinteticen proteínas de membrana dentro de células sintéticas utilizando un sistema de expresión libre de células.Mi laboratorio está trabajando en la reconstitución de varios canales iónicos en células sintéticas a través de la reconstitución del potencial de acción por un conjunto bien definido de canales iónicos.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

787 vistas.  University of Michigan, Ann Arbor. Nuestro protocolo aborda la reconstitución de una proteína de membrana dentro de la bicapa lipídica de una célula sintética elaborada mediante el método de emulsión de gota invertida. La ventaja de utilizar el método de emulsión de gotas invertidas es su capacidad para generar células sintéticas que proporcionan un entorno estable para la expresión libre de células de proteínas de membrana. Nuestro protocolo ofrece un método robusto para que los investigadores en el campo sinte...

Video: Autor destacado: Reconstitución de proteínas de membrana en células sintéticas

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.

Investigación

Bioingeniería

Bulk Cell-Free Expression Reactions with Small Unilamellar Vesicles (SUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, blow a gentle stream of Argonne into a glass vial containing POPC lipids while gently rotating the vial. When the lipids have dried as a film at the bottom of the vial, loosely cap it, then transfer it to a desiccater. After one hour add 0.5 milliliters of ultrapure deionized water to dissolve the lipid film.Vortex the solution for two minutes. Next, soak two filter supports and deionized water. Place them on each of the internal membrane supports.Then place a 100 nanometer polycarbonate filter between the two internal membrane supports, held together by the extruder outer casing and retainer nut. Place the setup in the extruder stand to finish setting up the mini extrusion apparatus. Next, load the lipid water mix into a one milliliter gast tight syringe.Use swing arm clips to secure the syringe into one end of the mini extruder. Insert the second syringe into the other end of the mini extruder, making sure that it is fully depressed. Now pass the lipid water mix from the original syringe into the empty one through the apparatus.After repeating the extrusion 11 times, transfer the SUVs to a 1.5 milliliter micro centrifuge tube. To assemble the cell-free expression protocol, pipette solutions one to 3 DNA plasmid encoding for soluble SFGFP or variants of glutamate receptor SFGFP, murine RNAse, and SUV solution into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Transfer the cell-free expression solution to a 96 well conical V bottom plate. Incubate the plate in a plate reader at 37 degrees Celsius for four to five hours. Set up the plate reader with a gain of 100, excitation of 485 nanometers, emission of 528 nanometers, a runtime of five hours, and an interval measurement of one read for every two minutes.Measure the GFP signal every two minutes to monitor the cell-free reaction in real time. Soluble SFGFP had the highest expression among all three proteins.

Reacciones de expresión libre de células a granel con pequeñas vesículas unilaminares (SUV) para aplicaciones de células sintéticas

Cell-Free Reactions in Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, prepare the GUV outer buffer solution in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Mixed together spermidine, ATP, GTP, CTP, UTP, creatine phosphate, magnesium acetate, potassium glutamate, HEPES, potassium hydroxide, folinic acid. glucose, and amino acid stock.Add ultra purified deionized water to bring the final volume of the solution to one milliliter. Next, in a fume hood, add 17.3 microliters of POPC stock solution to a 15-milliliter glass vial. To this, pipette 1.08 microliters of PEO-b-PBD copolymer.Carefully blow a gentle stream of argon gas into the glass vial while rotating the vial to evaporate the chloroform. Then pipette 1.2 milliliters of light mineral oil into the glass vial. Vortex the lipid and oil at maximum speed for 10 to 20 seconds.Place the glass vial in an oven at around 50 degrees Celsius for 20 minutes before vortexing for an additional 10 to 20 seconds at maximum speed. Next, pipette 270 microliters of the GUV outer solution into a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. To this, pipette 15 microliters each of five molar sodium chloride and 4.5 molar potassium chloride.Gently pipette 300 microliters of lipid and oil mixture on top of the GUV outer solution. After incubation, assemble a CFE reaction by pipetting Solutions 1 to 3, DNA plasmid encoding for soluble sfGFP or variants of glutamate receptor sfGFP, murine RNAse, and one molar sucrose into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Add 600 microliters of the lipid-oil mixture to the microcentrifuge tube containing the 20-microliter reaction mixture. Pipette up and down vigorously for one minute to emulsify the reaction. Gently layer the inner emulsion on top of the oil layer in the tube.Centrifuge for 10 minutes at 2000 g at four degrees Celsius. Next, carefully pipette out the excess oil and outer solution from the microcentrifuge tube. Gently mix the GUV pellet in the remaining solution to resuspend it.Transfer the GUV solution to a clean 96-well clear flat bottom plate for incubation. Transfer the sealed plate into a plate reader to incubate at 37 degrees Celsius for five to six hours. After incubation, place the plate on an inverted confocal microscope.Focus on a region of interest containing the GUVs, then capture the images at an excitation wavelength of 488 nanometers. Save the images in the TIFF format. Open the images in an image processing software.Click on the Brightness/Contrast setting panel to open it. Then adjust the brightness and contrast to make the fluorescent proteins visible. The wild-type glutamate receptor cell-free expression reactions encapsulated in GUV demonstrated excellent expression and membrane localization.PRSP-glutamate receptor was prone to aggregation and punctate formation. The soluble sfGFP was expressed in GUVS and stayed in the GUV lumen.