Para empezar, prepare la solución tampón exterior GUV en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Espermidina mezclada, ATP, GTP, CTP, UTP, fosfato de creatina, acetato de magnesio, glutamato de potasio, HEPES, hidróxido de potasio, ácido folínico. glucosa y aminoácidos.
Agregue agua desionizada ultra purificada para llevar el volumen final de la solución a un mililitro. A continuación, en una campana extractora, añada 17,3 microlitros de solución madre POPC a un vial de vidrio de 15 mililitros. Para ello, pipetea 1,08 microlitros de copolímero PEO-b-PBD.
Sople con cuidado un suave chorro de gas argón en el vial de vidrio mientras gira el vial para evaporar el cloroformo. A continuación, pipetee 1,2 mililitros de aceite mineral ligero en el vial de vidrio. Agite el lípido y el aceite a máxima velocidad durante 10 a 20 segundos.
Coloque el frasco de vidrio en un horno a unos 50 grados centígrados durante 20 minutos antes de agitar el vórtice durante 10 a 20 segundos adicionales a velocidad máxima. A continuación, pipetee 270 microlitros de la solución externa GUV en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para ello, pipetea 15 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y cloruro de potasio de 4,5 molares.
Pipetear suavemente 300 microlitros de mezcla de lípidos y aceite sobre la solución externa de GUV. Después de la incubación, ensamble una reacción CFE pipeteando las soluciones 1 a 3, plásmido de ADN que codifica para sfGFP soluble o variantes del receptor de glutamato sfGFP, ARNasa murina y sacarosa molar en un vial. Agregue agua desionizada ultrapura para llevar el volumen de reacción a 20 microlitros.
Agregue 600 microlitros de la mezcla de lípidos y aceite al tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de reacción de 20 microlitros. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante un minuto para emulsionar la reacción. Coloque suavemente la emulsión interna sobre la capa de aceite en el tubo.
Centrifugar durante 10 minutos a 2000 g a cuatro grados centígrados. A continuación, pipetee con cuidado el exceso de aceite y la solución exterior del tubo de microcentrífuga. Mezcle suavemente el gránulo GUV en la solución restante para volver a suspenderlo.
Transfiera la solución GUV a una placa de fondo plano transparente limpia de 96 pocillos para la incubación. Transfiera la placa sellada a un lector de placas para incubar a 37 grados centígrados durante cinco o seis horas. Después de la incubación, coloque la placa en un microscopio confocal invertido.
Concéntrese en una región de interés que contenga los GUV y, a continuación, capture las imágenes a una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros. Guarde las imágenes en formato TIFF. Abra las imágenes en un software de procesamiento de imágenes.
Haga clic en el panel de configuración de Brillo/Contraste para abrirlo. A continuación, ajuste el brillo y el contraste para que las proteínas fluorescentes sean visibles. Las reacciones de expresión libre de células del receptor de glutamato de tipo salvaje encapsuladas en GUV demostraron una excelente expresión y localización de la membrana.
El receptor de glutamato PRSP era propenso a la agregación y a la formación de puntos. El sfGFP soluble se expresó en GUVS y permaneció en el lumen GUV.
