Cultivo celular y ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA) Preparación de muestras para Western Blotting

Para empezar, agregue 264,7 células crudas en una placa de cultivo de 100 milímetros e incube con seis mililitros de DMEM a 37 grados centígrados con 95% de humedad y 5% de dióxido de carbono. Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, aspire el medio viejo, luego lave las células dos veces con dos mililitros de PBS calentado a temperatura ambiente. A continuación, agregue dos mililitros de PBS a cada plato que contenga células y mézclelas.

Recoja las células en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, luego centrifugue a 377 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en dos mililitros de PBS. Ahora, congele los tubos de microcentrífuga en nitrógeno líquido hasta que se forme un sólido blanco e inmediatamente descongele en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Centrifugar los tubos a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, tome dos tubos de microcentrífuga, uno con 100 micromolares de xanthatina y otro con un volumen igual de dimetilsulfóxido. Añadir 450 microlitros del sobrenadante centrifugado a cada tubo e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, transfiera 60 microlitros de sobrenadante de cada tubo de microcentrífuga a 14 tubos de PCR. Caliente los tubos simultáneamente a diferentes temperaturas durante tres minutos con dos tubos de PCR a cada temperatura. A continuación, coloque los tubos en la centrífuga.

Ahora, toma 48 microlitros de sobrenadante de cada tubo y añádelo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 12 microlitros de tampón de carga de proteínas SDS-PAGE a cada tubo. Calentar las muestras en vórtice en un baño de agua a 100 grados centígrados durante cinco minutos.