Para empezar, prepara el gel SDS-PAGE. Haga girar el marcador descongelado y las muestras de ensayo de desplazamiento térmico celular preparadas. Agregue 2,5 microlitros de marcador al primer pocillo y 20 microlitros de muestras a cada uno de los pocillos restantes.
Luego, haga funcionar el gel a 80 voltios. A continuación, agregue 850 mililitros de agua ultrapura, 100 mililitros de etanol anhidro y 50 mililitros de tampón de transferencia rápida a un vaso de precipitados y revuelva bien. Corta la membrana de fluoruro de polivinilideno o PVDF según el tamaño del gel y márcala.
Luego, sumérjalo en metanol durante 30 segundos para activarlo. Coloque las pinzas de transferencia, la almohadilla de esponja y tres capas de papel de filtro de transferencia en una bandeja que contenga el tampón de transferencia. Una vez completada la electroforesis, vierta la solución de electroforesis del dispositivo de electroforesis y retire la placa.
Retire suavemente el gel con un cuchillo de plástico y córtelo para visualizar claramente el marcador de proteínas y las proteínas objetivo. Después de lavar el gel en la solución transmembrana, colóquelo plano sobre papel de filtro. Sumerja la membrana de PVDF activado en la solución de transferencia.
Sostenga el lado etiquetado con pinzas y cubra el gel hacia abajo. Luego, coloque la configuración de transferencia ensamblada en el tanque de transferencia. Añada la solución transmembrana restante al casete transmembrana.
Ajuste la corriente y la hora, y presione ejecutar para iniciar la transferencia a temperatura ambiente. Ahora, agregue seis mililitros de solución de 5%BSA con TBST a la caja de incubación. Una vez completada la transferencia, retire la membrana de PVDF de la configuración mientras sujeta el lado del marcador y colóquela en la caja de incubación.
Después de retirar la solución BSA de la caja de la incubadora, agregue seis mililitros de anticuerpo primario. Coloque la caja de incubación en una caja de espuma con bolsas de hielo durante la noche mientras agita. Al día siguiente, recoja el anticuerpo primario en un tubo y lave la membrana con seis mililitros de solución de TBST.
Después, añade seis mililitros de anticuerpo secundario a la caja de incubación. Al final de la incubación, recoja el anticuerpo secundario y lave la membrana cinco veces con TBST como se muestra anteriormente. Mezcle volúmenes iguales de los reactivos quimioluminiscentes A y B.Abra el sistema de imágenes en gel.
Haga clic en las muestras, verifique la calibración y espere a que se complete la calibración. A continuación, haz clic en el marcador y comprueba la calibración. Ahora recoja el lado marcador de la tira con pinzas y sumérjalo completamente en la solución reactiva quimioluminiscente.
Sujete un lado del marcador para colocar la tira boca abajo en el generador de imágenes y cierre la tapa del mismo. Establezca el tiempo de exposición en un segundo y haga clic en Capturar. Haga clic en Guardar.
Asigne un nombre a la imagen y guárdela como un archivo TIFF. El ensayo de cambio térmico celular mostró que Xanthatin cambia notablemente la estabilidad térmica de la proteína Keap1 dentro del rango de temperatura de 48 a 57 grados Celsius en comparación con el grupo dimetilsulfóxido.
