Antes de conectar el tubo esterilizado al biochip, enjuague primero el tubo con 200 microlitros de PBS seguido de 200 microlitros de medio EC. Después de enjuagar la cámara superior e inferior con un medio de cultivo celular recién preparado, inserte el depósito en el lado de salida del biochip y conecte el depósito con el tubo a la entrada del biochip. Para una profusión circular en medio, conecte el tubo al depósito y al biochip.
Ahora llene el depósito con 500 microlitros de medio EC. Conecte el biochip con el tubo para iniciar la profusión a un caudal de 21 microlitros por minuto. Al día siguiente, detenga la profusión y vacíe los depósitos.
Bajo un armario de seguridad estéril, pipetee 500 microlitros de medio EC en los depósitos y enjuague suavemente la cámara inferior con 200 microlitros de RPMI más medio. A continuación, reinicie la perfusión a un caudal de 21 microlitros por minuto. Para establecer una interfaz aire-líquido desde el día 12 hasta el día 14, abra los tapones de la cámara inferior y absorba con cuidado el medio hasta que se vea una burbuja de aire.
Después de asegurarse de que se ha eliminado todo el líquido del canal y la cámara, cierre cuidadosamente los puertos, llene el depósito con medio EC vascular recién preparado y continúe el cultivo de profusión solo en la cámara superior hasta el día 14. Desconecte los biochips del sistema de flujo. Después de retirar el tubo, examine las capas celulares del biochip bajo un microscopio para detectar la confluencia celular.
Lave las cavidades de los biochips con PBS para eliminar el medio de cultivo celular. Agregue 300 microlitros de solución de paraformaldehído al 4% en PBS a la cámara superior y 200 microlitros a la cámara inferior. Después de 10 minutos de incubación, lave la cámara tres veces con PBS.
Para la permeabilidad, añadir 300 microlitros de Triton X 100 al 0,25% en PBS e incubar durante 30 minutos, después del lavado con PBS, pipetear 300 microlitros de albúmina sérica bovina al 3% en PBS en ambas cámaras e incubar durante una hora. Para la tinción inmunofluorescente, prepare 50 microlitros de soluciones de anticuerpos utilizando 3 % de BSA para cada membrana utilizando proporciones de dilución adecuadas. Para acceder a las células dentro del biochip, haga un corte exacto a través del exterior de la cavidad y retire la lámina de unión.
Con un bisturí, corte la membrana quitando los bordes sellados al biochip. Después de dividir la membrana en dos piezas, recoja las piezas de membrana con una pinza y colóquelas en un portaobjetos microscópico para teñir, agregue 50 microlitros de solución de anticuerpos a cada pieza de membrana e incube durante la noche a cuatro grados centígrados, protegiendo de la luz. Después de lavar la membrana tres veces con PBS, agregue una gota de medio de montaje en el portaobjetos etiquetado y coloque la membrana correspondiente.
Agregue una gota del medio de montaje en la parte superior de la membrana y coloque un cubreobjetos. La tinción por inmunofluorescencia de células endoteliales de la vena umbilical humana reveló alteraciones morfológicas y expresión de marcoproteínas después de 14 días de cocultivo. En el lado vascular, la expresión coherente de V en los bordes de las células endoteliales sugirió confluencia y formación de barreras endoteliales.
En el lado epitelial se evaluó la expresión de ecaherrina y proteína surfactante A, lo que indica la integridad y función del epitelio alveolar.
