Para comenzar, fije un goniómetro de dos ejes con una placa de titanio a la placa de la platina para el posicionamiento XY bajo el microscopio. Active el software de escaneo, configure los píxeles en 512 por 512 bidireccional para activar usando una lente de objetivo de 20X. Después de realizar la cirugía de ventana craneal, coloque al cachorro que expresa GCaMP en un lado del hemisferio en la almohadilla térmica.
Con tornillos, fije la barra de titanio de montaje de la cabeza a la placa de titanio. A continuación, ajuste el ángulo de la ventana horizontalmente con el goniómetro. Ilumine la superficie del cerebro con la luz de fondo y seleccione el área de imagen utilizando el posicionamiento XY con una lente de objetivo 5X.
Bajo una lente de inmersión en agua 20X, administre gotas oftálmicas en la ventana craneal. Después de desactivar la luz de fondo, escanee la superficie del cerebro en un modo de fotones. Aumente la intensidad del láser para visualizar la autofluorescencia verde del vidrio y la superficie del cerebro.
Cubra el microscopio para evitar la interferencia de la luz externa. Inicie el software de escaneo en modo de dos fotones para la obtención de imágenes. A continuación, calibre la potencia del láser y la ganancia del detector para visualizar de forma óptima las señales GCaMP.
Localice la profundidad en un área de imágenes poblada por muchas neuronas que expresan GCaMP e inicie la generación de imágenes de lapso de tiempo para capturar señales de GCaMP. La microscopía de dos fotones reveló actividades neuronales de la capa cuatro en la corteza barril de un cachorro de sexto día postnatal con fluorescencia verde. El GCaMP verde era más prominente, lo que resultó en una fuga de señal en el canal rojo y la identificación de 14 regiones de interés.
