Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia, especialmente aquellos relacionados con la formación de zócalos de neurona. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden analizar los cambios morfológicos de las neuronas individuales en ratones neonatales vivos. Comience con un cachorro anestesizado después del parto cinco y proceda sólo en ausencia de una reacción a la prueba de pellizcar la cola.
Primero, esteriliza el cuero cabelludo limpiándolo con 70%etanol. Luego, usa tijeras esterilizadas con 70%etanol para eliminar aproximadamente 20 milímetros cuadrados de la piel que cubre el cráneo. A continuación, utilice fórceps estériles y un hisopo de algodón limpio empapado en tampón de corteza, para eliminar la fascia del cráneo.
Utilice una punta de carga para aplicar adhesivo tisular en la superficie de la piel incizada para detener el sangrado evitando la superficie a tomar imágenes. Coloque el cachorro en otra almohadilla de calentamiento, establecido en 37 grados Celsius, y deje que se recupere de la anestesia. Espere aproximadamente 30 minutos hasta que el adhesivo del tejido se haya secado y solidificado.
Una vez que el adhesivo de tejido se haya secado, comience la preparación de la ventana craneal en el ratón anestesiado. Aplica una gota de tampón de corteza sobre el cráneo, luego usa una cuchilla de afeitar estéril para abrir cuidadosamente un área de un milímetro de diámetro del cráneo, dejando la dura intacta. Aplique el tampón de la corteza para mantener la superficie del cerebro húmeda.
Use un pequeño trozo de esponja de gelatina empapada en tampón de corteza para detener cualquier sangrado. Utilice una pieza nueva para comprimir un lado de la craneotomía y drenar cualquier tampón y sangre de la superficie dural sin tocar la dura. Este es el paso más crítico para preparar una ventana clara.
La dura debe estar intacta y el cepillo debe retirarse de la duración expuesta. A continuación, utilice una punta de pipeta para aplicar una capa delgada de un porcentaje de agarosa de fusión baja, disuelta en tampón de corteza. Aplica un resbalón redondo de vidrio de tres milímetros sobre la capa de gel de agarosa.
Retire todas las burbujas entre el resbalón de la cubierta y la capa de gel de agarosa vertiendo en exceso de gel de agarosa entre ellas. Use pinzas para eliminar el exceso de gel, sobresaliendo de debajo del resbalón de la cubierta. Mezclar el polvo de cemento y el líquido de cemento.
Utilice una punta de pipeta para aplicar la mezcla en el cráneo antes de que se solidifice. A continuación, adjunte una barra de titanio hecha a medida al hueso craneal utilizando cemento dental. Alinee la barra de titanio y la cubierta se deslice en paralelo para capturar imágenes fácilmente.
Cubra el cráneo expuesto con cemento dental. Luego, inyecte por vía subcutánea un analgésico. Coloque al cachorro en una jaula de recuperación en una almohadilla de calor de 37 grados centígrados durante una hora hasta que el cemento dental se haya solidificado.
Para comenzar la toma de imágenes, primero establezca la longitud de onda del láser de dos fotónicos. Para la excitación RFP, utilice una longitud de onda de 1000 nanómetros. Limpie la superficie del resbalón de la cubierta con 70%etanol.
Fije el cachorro anestesiado a la placa de titanio en el escenario de imágenes, utilizando la barra de titanio. Utilice la etapa de goniómetro, para ajustar la cabeza, de modo que el resbalón de la cubierta es paralelo a la lente objetivo. Mantener la temperatura corporal del cachorro durante la toma de imágenes utilizando una almohadilla de calentamiento establecida en 37 grados Celsius y reducir la concentración de isoflurano a 0.7%a 1%Coloque la etapa de imagen bajo la lente objetivo 20x del microscopio de dos fotones.
Aplique una gota de agua en el resbalón de la cubierta. Configure el software para adquirir imágenes de pila Z a intervalos de 1,4 micras. Para las imágenes de neuronas de capa cuatro, establezca el ancho Z en entre 150 y 300 micras para crear una imagen de toda la morfología dendrítica.
Utilice el escaneo lento y el promedio para obtener imágenes claras que muestren la morfología neuronal. Por lo general, se tarda más de 20 minutos en adquirir toda la morfología dendrítica. Esta imagen muestra una imagen representativa de la pila Z de la capa cuatro neuronas corticales del cachorro P5.
La flecha indica la neurona que se va a analizar. Las neuronas con dendritas borrosas deben eliminarse del análisis. Esta imagen muestra una imagen de aumento más alta de la neurona indicada en la imagen anterior.
Las puntas de flecha azules indican puntas dendríticas que se retraerán en el siguiente punto de tiempo, y las pequeñas puntas de flecha blancas indican el axón de una celda vecina. Después de 4,5 horas, las puntas dendríticas con puntas de flecha azules se retraen, y las puntas dendríticas con puntas de flecha amarillas son alargadas. Aquí se muestra una reconstrucción de morfología dendrítica representativa, las neuronas que muestran dendritas desconectadas como se ve aquí, deben ser excluidas de los análisis.
Al intentar este procedimiento, es importante mantener la dura intacta durante el proceso. Usando este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como en la toma de imágenes de propulsión para responder preguntas adicionales relacionadas con el patrón de actividad de la neurona en el cerebro neonatal.
