Con alrededor de 100 millones de células en el cerebro del ratón y tamaños de imágenes de resolución celular de todo el cerebro que se acercan a la escala de terabytes, se necesitan herramientas avanzadas de análisis de imágenes para cuantificar con precisión las células. Nuestra tubería computacional puede preprocesar imágenes y cuantificar núcleos dentro de la corteza del ratón mientras mantiene un compromiso razonable entre la precisión de detección celular, el tiempo de imagen y los recursos computacionales. Demostrando el procedimiento estarán Felix Kyere e Ian Curtin, estudiantes graduados de mi laboratorio.
Para comenzar, monte la muestra en el soporte de tamaño de muestra correcto de modo que la muestra esté orientada con la dimensión z de no más de 5,2 milímetros de profundidad debido a la distancia nominal de trabajo del microscopio UltraMicroscope II. Luego inserte el soporte en la base de muestra de modo que el tornillo del soporte esté en un ángulo de 45 grados con respecto a los soportes de la base. A continuación, coloque la base en una posición tal que la muestra esté orientada perpendicularmente a la trayectoria de la luz.
Después, ajuste el cuerpo del zoom en el microscopio a un aumento de 4x o más, lo que produce 0,75 micrómetros por píxel. En el software Inspector Pro, seleccione una sola hoja de luz con un valor de apertura numérico de aproximadamente 0,08. Para garantizar que la resolución axial se mantenga a lo largo del ancho de la imagen, seleccione Enfoque dinámico horizontal y aplique el número recomendado de pasos en función de la longitud de onda del láser.
A continuación, ajuste el enfoque fino para cada canal con respecto al canal de registro y la potencia láser por canal con respecto a las propiedades del canal. A continuación, ajuste el ancho de la hoja de luz a aproximadamente el 50% para garantizar que la potencia de la hoja se distribuya de manera óptima en la dimensión y para el tamaño de la muestra. Después, establezca el número de mosaicos con respecto al tamaño de la muestra con una superposición recomendada del 15% entre mosaicos y capture imágenes para cada canal secuencialmente para cada pila en una posición de mosaico determinada.
Primero, descargue e instale el administrador de entorno Conda para Linux y las herramientas de procesamiento de imágenes NuMorph. En la línea de comandos, ejecute matlab y NM_setup. m de NuMorph para descargar e instalar los paquetes de software de análisis de imágenes necesarios para el análisis.
A continuación, especifique los nombres de ejemplo, los directorios de entrada y salida, la información del canal y los parámetros de imagen de la hoja de luz editando el archivo NM_samples.m. Para el ajuste de intensidad, en NMp_template, establezca el ajuste intenso en verdadero y use_processed_images como falso cuando trabaje con un nuevo conjunto de imágenes. A continuación, establezca save_images y save_samples como verdaderos.
A continuación, establezca el sombreado de mosaico en básico para aplicar la corrección de sombreado utilizando el algoritmo básico, o manual para aplicar la corrección de sombreado de mosaico utilizando mediciones del Ultramicroscopio II en anchos de hoja de luz específicos. Para la alineación del canal de imagen, en NMp_template, establezca channel_alignment en true y alignment_method de canal en traducción o elásticos. A continuación, establezca sift_refinement como verdadero y el valor de superposición de 0,15 para que coincida con las superposiciones de mosaicos durante la creación de imágenes.
Para ejecutar pasos de preprocesamiento en MATLAB, especifique el nombre de la muestra y establezca la configuración en NM_config muestra de proceso. A continuación, ejecute cualquiera de los pasos de preprocesamiento especificando NM_process puntada de configuración mientras especifica la etapa mediante intensidad, alineación o puntada, y compruebe en el directorio de salida los archivos de salida para cada una de las etapas. Comience con una imagen de Atlas 3D y una imagen de anotación asociada que asigne cada vóxel a una estructura particular.
Alinee tanto la imagen del Atlas como el archivo de anotación para asegurarse de que coinciden correctamente en la orientación correcta. Después de la alineación, procese los archivos en NuMorph para especificar las entradas como se describe en el manuscrito ejecutando el comando. En NMa_template, establezca resample_images en verdadero y resample_resolution para que coincida con el Atlas.
A continuación, especifique el número de canal que se va a volver a muestrear mediante resample_channels. Después, establezca register_images en true, especifique el atlas_file para que coincida con el archivo en el directorio Atlas y establezca registration_parameters como predeterminado. A continuación, establezca save_registered_images en true.
Para la detección de núcleos, el recuento de células y la clasificación, establezca tanto count_nuclei como classify_cells como verdaderos. A continuación, establezca el count_method en 3dunet y min_intensity para definir un umbral de intensidad mínima para los objetos detectados. A continuación, establezca classify_method en un umbral que se basa en una intensidad de fluorescencia no supervisada en posiciones de centroide, o SVM que modela un clasificador de máquina de vector de soporte lineal supervisado.
Para realizar pasos de análisis en MATLAB, especifique el nombre de la muestra y establezca la configuración en NM_config muestra de análisis. A continuación, ejecute cualquiera de los pasos de análisis especificando NM_analyze etapa de configuración mientras especifica la etapa mediante remuestrear, registrar, contar o clasificar y compruebe en el directorio de salida los archivos de salida para cada una de las etapas. En NMe_template, establezca update en true y compare_structures_by en cualquiera de los índices.
A continuación, establezca el archivo de plantilla y la tabla de estructura que especifica todos los índices de estructura posibles y las estructuras para evaluar mientras se especifica el recuento de celdas y la clasificación del tipo de celda. La limpieza del tejido utilizando el protocolo iDISCO + y marcadores de núcleos específicos de la capa neuronal dio como resultado grupos celulares claramente definidos de neuronas de la capa superior e inferior en la isocorteza. El conteo de células utilizando NuMorph dependía de los pasos exitosos de preprocesamiento que incluían el ajuste de intensidad, la alineación del canal y la costura.
Sin embargo, los errores en los pasos de preprocesamiento podrían dar lugar a una costura incorrecta, lo que llevaría a una alineación y costura incorrectas y, por lo tanto, daría lugar a imágenes con un patrón enfocado y desenfocado. Para contar núcleos de regiones cerebrales específicas, las imágenes cosidas se anotarán utilizando Atlas, lo que permitirá que las anotaciones se superpongan en las regiones del cerebro. Los centroides de los núcleos se detectaron con un modelo 3D U-Net entrenado en NuMorph con alrededor de 12 millones de núcleos totales que eran TO-PRO-3 positivos en la isocorteza con aproximadamente 2,6 millones de núcleos cerebro-dos-positivos y 1,6 millones CTIP2-positivos.
Se detectaron alrededor de 3,7 y 2,9 millones de núcleos totales positivos para TO-PRO-3 en los ganglios basales y la corteza alopálctica del hipocampo, respectivamente. Sin embargo, las células cerebrales dos positivas detectadas en estas dos regiones cerebrales fueron insignificantes, y solo se detectaron alrededor de 1.5 en menos de un millón de células positivas para CTIP2 en los ganglios basales y el alocórtex del hipocampo. Realizar controles de calidad visual durante la adquisición para lograr una buena segmentación.
Y configure correctamente el entorno de Conda para garantizar que no se encuentren errores en un análisis posterior. Además del recuento celular, esta tubería permite la integración con otras herramientas de segmentación que miden el tamaño y la forma de las células que luego se pueden comparar entre grupos de genotipos. Con nuestra cartera, podemos identificar cómo cambia la anatomía del cerebro a la resolución celular, lo que lleva a la identificación de tipos de células y regiones cerebrales importantes para el riesgo de enfermedad.
