Para comenzar, coloque HEK293T células en placa agregando 22 mililitros de medio de cultivo suplementado en 10 placas de cultivo tratadas de 15 centímetros de diámetro. Incubar las placas durante 24 horas para alcanzar un 70 a 80% de confluencia. Para la transfección celular, prepare una mezcla combinando los reactivos en un tubo de microcentrífuga y mezcle mediante golpecitos.
Agregue la mezcla de transfección a 4,56 mililitros de DMEM no suplementado en un tubo de centrífuga de 50 mililitros y mezcle mediante golpecitos. A continuación, añadir 1,37 mililitros de solución estéril de polietilemina gota a gota. Mezclar golpeando e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos para formar complejos de ADN polietileneimina.
Agregue esta mezcla en 231 mililitros de DMEM suplementado precalentado. Reemplace el medio de cultivo en cada placa de cultivo con 22 mililitros de esta mezcla de transfección e incube las células durante 48 horas. Si el PITR codifica un indicador fluorescente, observe las células transfectadas bajo un microscopio de fluorescencia.
A continuación, recoge el medio de cada plato. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos y retirar el sobrenadante. Luego, agregue 10 mililitros de PBS precalentado a la placa y use un raspador de células para eliminar las células.
Recoja la suspensión celular en los tubos de centrífuga que contienen el pellet de celda. Asegúrese de que todas las células se recojan lavando cinco platos a la vez con 10 mililitros de PBS. Vuelva a centrifugar para granular las células.
Para la extracción con rAAV, descongele los gránulos celulares transfectados y vuelva a suspenderlos en 100 mililitros de tampón estéril y pipetea para garantizar una suspensión homogénea. A continuación, añadir 12,5 mililitros de una solución estéril y estéril de desoxicolato de sodio al 10% recién preparada para inducir la lisis celular y mezclar mediante pipeteo. Agregue 27 microlitros de benzonasa nucleasa y mezcle bien hasta que la mezcla ya no sea viscosa.
Incubar a 37 grados centígrados, con vórtices cada 10 minutos, durante una hora. Centrifugar a 3.000 g durante 60 minutos a 25 grados centígrados. Filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de PVDF de 0,45 micras en un nuevo recipiente estéril.
