Para comenzar, prepare el sistema FPLC para la purificación. Enjuague a fondo la ruta del flujo de líquido con agua ultrapura estéril siguiendo instrucciones manuales o un método personalizado. Conecte una columna de heparina preempaquetada de un mililitro.
Ajuste la alarma de presión. Y lavar con cinco columnas de agua ultrapura a un caudal de un mililitro por minuto. A continuación, cambie las soluciones para las bombas del sistema para prepararlas para la aplicación de muestras.
Lave la bomba del sistema B con el tampón B y llene el resto de la ruta del flujo de líquido con el tampón A. Inserte el tubo de muestra de la bomba de muestra en la preparación viral. Alternativamente, use un súper bucle para la muestra. Inserte el tubo de salida en un recipiente nuevo.
Al realizar la purificación por primera vez, defina un método personalizado para la purificación automática. Después de habilitar los ajustes generales de purificación, el método cebará la ruta de flujo desde la entrada de muestra S1 hasta la válvula de inyección con la solución de muestra. A continuación, equilibre la columna con un total de cinco volúmenes de columna utilizando el 12,5% del tampón B a una tasa de un mililitro por minuto.
Aplique la muestra a la columna a 0,5 mililitros por minuto y recoja el flujo a través del puerto de salida. Lave la columna con 20 volúmenes de columna de tampón A a un mililitro por minuto. A continuación, eluir la muestra a un mililitro por minuto con este esquema.
Seleccione recoger la muestra eluida en fracciones de un mililitro utilizando un colector de fracciones. A continuación, vuelva a equilibrar la columna a un mililitro por minuto con un 12,5% de tampón B para volúmenes de cinco columnas. Abra el método creado y espere el paso de elución.
Recoja las fracciones usando un colector de fracciones. Además, recoja una alícuota del flujo y almacene las fracciones a menos 20 grados centígrados. Evalúe el cromatograma guardado automáticamente de todos los pasos de purificación.
Incluyendo el perfil de elución. Una vez finalizado, cambie las entradas de las soluciones tampón a agua ultrapura y lave la columna a un mililitro por minuto para volúmenes de cinco columnas. Restaurando la columna, cambie las entradas de agua ultrapura a 20% de etanol y lave la columna durante cinco volúmenes de columna.
Para concentrar los rAAV, cargue las fracciones de FPLC deseadas en una unidad de filtro centrífugo de 15 mililitros con un límite de peso molecular de 100 kilodalton. Centrifugar a 2.000 g durante dos minutos a temperatura ambiente para alcanzar un volumen concentrado de aproximadamente 500 microlitros. Continúe con el cambio de tampón agregando un mililitro de PBS estéril a la unidad de filtro centrífugo.
Lave el filtro mediante pipeteo. Y centrifugar en intervalos de un minuto hasta alcanzar un volumen de 500 microlitros. Concentre aún más los rAAV transfiriendo esta muestra de 500 microlitros a una unidad de filtro centrífugo de 0,5 mililitros con un corte de 100 kilodalton.
Y centrifugando a 6.000 g durante intervalos de un minuto hasta que el volumen sea inferior a 100 microlitros. Recupere el rAAV concentrado invirtiendo el dispositivo de filtro en un nuevo tubo de microcentrífuga y centrifugando para transferir los rAAV al tubo. Aliquot los rAAV en tubos de microcentrífuga de baja retención y almacene a menos 80 grados Celsius.
La pureza de las preparaciones de rAAV se analizó utilizando la página SDS, revelando distintas bandas de proteínas de la cápside. La visualización de partículas virales por TEM mostró partículas vacías con un centro denso en electrones y partículas llenas. La evaluación de las propiedades de impureza física de los rAAV utilizando la plataforma aturdidor reveló partículas de cápside intactas de alrededor de 30 nanómetros, título general de cápside, proteínas libres y agregadas y ADN monocatenario.
Los ensayos de infectividad en células neuro 2a mostraron altos niveles de infectividad. Se demostraron cultivos neuronales primarios infectados con las preparaciones virales. Propiedades de transferencia génica preservadas.
La transducción in vivo del cerebelo de ratones con vectores rAAV dio lugar a una expresión prolongada de GFP. Indica una expresión exitosa de transgenes en el cerebro de los mamíferos.
