Para comenzar, pipetee 10 gotas de microlitros de solución de péptidos 2X en el centro de los pocillos en una placa de 24 pocillos. Después de la incubación, pipetee 10 microlitros de 2X PBS en cada pocillo. Utilice la punta de la pipeta para mezclar la solución suavemente, deje que las gotas de gel se estabilicen durante al menos 20 minutos, asegurándose de que las gotas estén intactas.
A continuación, pipetee 2,5 mililitros de EDTA de tripsina al 0,0125% en un matraz que contiene 2 millones de células de adenocarcinoma colorrectal humano SW1222. Incubar las células con tripsina a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos hasta que se desprendan del matraz. Añadir cinco mililitros de medio completo para inactivar la tripsina.
A continuación, filtre la suspensión celular con un colador de células de 30 micrómetros. Con una micropipeta de 10 microlitros, inyecte dos microlitros de la suspensión celular en cada gota de péptido. Siembre 800 células de la línea celular SW1222 en cada pocillo durante cuatro días.
Incubar las gotas durante 30 minutos a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono. A continuación, añada 0,5 mililitros de medio suplementado a cada pocillo. Para preparar el control, diluya el stock del control de la matriz de membrana basal con medio suplementado.
Cargue la suspensión de la celda en la solución basal de membrana diluida. Pipetear 20 microlitros de matriz de membrana basal diluida en cada pocillo con las células. Incubar las células durante 20 minutos a 37 grados centígrados.
Después de que las gotas se solidifiquen, agregue 0,5 mililitros de medio completo. Tome imágenes de las células utilizando un microscopio de campo claro en los días uno, cuatro y siete para evaluar el crecimiento de los organoides. Una semana, las imágenes de campo claro de las células mostraron que los pequeños grupos de células se estaban ensamblando en organoides.
Los organoides derivados de SW1222 cultivados en hidrogeles peptídicos tenían una morfología redonda con un aspecto ligero. Una apariencia más oscura indicaba una densidad más alta indeseable como se observa en las colonias del péptido P en el día siete.
