Inmunotinción de organoides derivados del cáncer colorrectal en hidrogel peptídico

Para comenzar, pipetee 20 gotas de microlitros de hidrogel peptídico en una placa de 24 pocillos. Siembre 800 células de la línea celular SW1222 en cada pocillo durante cuatro días. En el cuarto día, pipetee el medio.

Lave cada pocillo dos veces con PBS. Luego, agregue 400 microlitros de solución de formaldehído al 4% en los pocillos. Una vez finalizada la incubación, utilice una punta de pipeta P1000 para aspirar la solución de formaldehído.

Luego, lave los pozos con PBS una vez más. Incubar las células en un mililitro de tampón de permeabilización durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de pipetear el tampón y lavar los pocillos con PBS, agregue 0,5 mililitros de tampón de bloqueo.

Ahora, lave los pozos con PBS después de quitar el tampón de bloqueo. A continuación, pipetee 200 microlitros de anticuerpo primario diluido en los pocillos. Incubar la placa durante la noche a cuatro grados centígrados.

Con una punta de pipeta P200, retire la solución. Luego, lave los pozos con una solución de PBS. A continuación, agregue faloidina conjugada a un vial de anticuerpo secundario diluido en una proporción de uno a 40.

Pipetea esta mezcla en los pocillos del plato. Luego, incube la placa a temperatura ambiente durante tres horas en la oscuridad. Después de aspirar la solución y lavar los pocillos con PBS, pipetee 300 microlitros de solución DAPI en cada pocillo.

Después de la incubación, lave los pocillos con PBS nuevamente después de pipetear la solución. Guarde el plato a cuatro grados centígrados durante un máximo de siete días. La inmunotinción mostró que los organoides encontrados en el péptido no biofuncional P, el péptido biofuncionalizado P1 y el Matrigel se encontraron localizados en las membranas apical y basolateral.

El péptido no biofuncional P indujo la expresión de la unión célula-célula en la membrana basolateral.