Para comenzar, ensamble un microscopio de disección, dos pinzas con puntas finas, tijeras, una aguja de jeringa de un mililitro y papel de filtro en una plataforma de trabajo. A continuación, con unas tijeras de codo, nuclea los ojos de un ratón anestesiado. Coloque los ojos en un plato de vidrio que contenga 4% de paraformaldehído y 0,2% de ácido pícrico en tampón de fosfato 0,1 molar.
En el microscopio de disección, usando una jeringa de un mililitro, haga un agujero en el limbo corneal y corte el segmento anterior con unas tijeras. Use fórceps para extraer el cristalino de la superficie interna de la retina. Ahora, con dos pinzas, pegue cuidadosamente la esclerótica hasta que la retina quede completamente aislada de la copa del ojo.
Posteriormente, corta la retina en cuatro trozos. Después de la fijación durante la noche y la solución de paraformaldehído al 4%, lavar los tejidos de la retina en PBS 0,01 molar seis veces durante 10 minutos cada una. Incubar el tejido de la retina en borohidruro de sodio al 1% en PBS 0,01 molar durante 30 minutos.
Nuevamente, lave las secciones de la retina en PBS de 0.01 molares al menos seis veces. A continuación, retira el vítreo con papel de filtro. Y con una cuchilla de afeitar de doble filo, corta la retina en pequeñas secciones de entre 100 y 300 micrómetros.
Lave las tiras de la retina en PBS 0,01 molar seis veces durante 10 minutos cada una antes de incubarlas con el reactivo A y el reactivo B del kit ABC durante dos días. A continuación, lave las rayas de la retina en un tampón tris de 0,05 molares tres veces durante 10 minutos cada una. Preincubar las tiras de retina con 5%Reactivo 1 y 5%Reactivo 3 del kit de diaminobenceno, o DAB, en agua destilada durante una hora a temperatura ambiente.
Para teñir las rayas de la retina con DAB, añada el mismo volumen de solución de tres tubos del kit DAB en secuencia. Bajo el microscopio de disección, observe la condición de tinción. Lave las tiras de retina con tampón tris molar 0.05 tres veces durante 10 minutos cada una.
Por último, lave las tiras en PBS 0,01 molar seis veces durante 10 minutos cada una. En experimentos de control, los pedículos cónicos con dos cintas y la varilla esférica con una cinta no mostraron inmunorreactividad en ausencia de anticuerpos primarios. La proteína quinasa C alfa identificó las células bipolares de los bastones en la retina.
El pie DAB muestra la presencia de la proteína quinasa C alfa y dendritas de células bipolares, formando sinapsis con terminales de bastones y conos en la capa plexiforme externa. Además, el producto de reacción DAB ayuda a identificar los terminales de las células bipolares de varilla y los procesos axonales en la capa plexiforme interna. Se demostró que las células amacrinas con inmunorreactividad de la sustancia P son presinápticas a las células amacrinas negativas para la sustancia P.
Además, las células amacrinas con inmunorreactividad de la sustancia P eran terminales postsinápticas a bipolares en los niveles de la subcapa tres y la subcapa cinco de la capa plexiforme interna, respectivamente.
