Los autores desean agradecer a la Sra. Alexia Saunders y la Sra. Michelle McPhedran de asistencia experimental, la Sra. Helen Feng para la fabricación de electrodos, el Dr. Penny Allen y el Dr. Jonathan Yeoh para la asistencia quirúrgica, el personal del Royal Victorian Eye y el Hospital de Biological Ear Centro Internacional de Investigaciones para el cuidado de los animales, Prof. Rob Pastor de orientación, en todo, y el Dr. Bryony Nayagam y el Sr. Ronald Leung de comentarios críticos sobre un borrador del manuscrito. Este trabajo se realizó en el Instituto de Biónica y el Hospital de St Vincent, Melbourne. El financiamiento fue proporcionado por la Fundación Ian Potter, el John T Reid Charitable Trusts, y el Consejo Australiano de Investigación a través de la Iniciativa Especial de Investigación en Ciencias de la Visión Biónica y la concesión Tecnología de Bionic Vision Australia (BVA). El Instituto Bionics reconoce el apoyo que recibe del Gobierno de Victoria a través de su Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa.

1. Enucleación y posteriores a la fijación Este protocolo asume que el sujeto ha sido implantado unilateralmente con una matriz de electrodos supracoroidal. <ol><li> Preparar soluciones Postfix en vidrio Schott botellas. <ol class="lalpha"><li> Solución fijadora de Davidson, 2x 100 ml <ul><li> 2 ml de formol (formaldehído al 37%) </li><li> 10 ml de ácido acético glacial (99,7%) </li><li> 35 ml de etanol (98%) </li><li> 53 ml de agua destilada </li></ul></li><li> Etanol al 50%, 2x 100 ml </li><li> Etanol al 70%, 2x 100 ml </li></ol></li><li> Transcardially perfundir sujetos con agua caliente (37 ° C) solución salina heparinizada seguida por el frío (4 ° C) formalina tamponada neutra (10%). </li><li> Tie suturas en el limbo superior (o una ubicación que es remota desde la matriz supracoroidal) de ambos ojos - en línea con un músculo recto, para servir como un punto de referencia. </li><li> Ojos enuclear, el mantenimiento de los cables externos del ojo implantado. </li><li> Coloque each ojo en 100 ml de solución fijadora de Davidson y dejar de publicar-fix a temperatura ambiente. </li><li> Después de 18 - 36 horas en fijador de Davidson, traslado al 50% de etanol (temperatura ambiente) durante 6 - 8 horas, y finalmente a 70% de etanol (temperatura ambiente). </li><li> Refrigerar las muestras a 4 ° C y la tienda hasta la disección. </li></ol> Globos oculares intactos y presurizada se han almacenado de esta manera durante hasta 3 meses sin afectar negativamente a la histología resultante. 2. Identificación y Mapeo de tejidos El protocolo de fijación anterior (paso 1) ha hecho que la translúcida esclerótica y la matriz es ahora visible - incluyendo los sitios de los electrodos individuales (Figura 3). <ol><li> Retire el mundo implantado a partir de etanol y recortar con cuidado el exceso de tejido, incluyendo la conjuntiva y la cápsula de Tenon. Recorte del nervio óptico a un 2 - 3 mm de longitud (Figura 3). </li><li> El uso de un colorante histológico markinesquema g, etiquete los electrodos con un código de color predefinido, teniendo cuidado de no ensuciar el medio de contraste. </li></ol><ul><li> Elegimos una suite disponible en el mercado de tinte histológico especializado (véase el apéndice). Pequeñas cantidades del colorante se aplicaron cuidadosamente con un pincel fino de pintura punta (tamaño Roymac 00) para el tejido y se dejaron secar al aire durante un máximo de 5 min. </li><li> Para nuestros propósitos, hemos elegido: verde para el electrodo activo (s) que fue (fueron) estimuló al máximo, a niveles suprathreshold, durante la duración del estudio, el rojo para otros electrodos activos, de color amarillo para los electrodos de retorno de mayor diámetro, y azul para guías adicionales y / o marcas de distancia anatómicas (Figuras 3B y 3C). </li><li> Algunos de ensayo y error puede ser necesaria para encontrar un medio de contraste que es estable a lo largo de los pasos siguientes. Por ejemplo, en la Figura 4, se puede observar que el colorante verde era más resistente que el tinte rojo. La dilución del colorante en etanol al 70% ayuda a mejorar Penet lípidosración y recubrimiento de tejido. </li><li> Es útil para esbozar o fotografiar el mundo teñido para referencia futura. </li></ul><ol start="3"><li> Volver a etanol al 70% para deshidratar el colorante. </li><li> Repita el paso 2.1 para el mundo de control no implantado. </li><li> Uso de las suturas de la etapa 1.3, alinee el ojo de control y el ojo implantado como un par duplicado. </li><li> Coloque una plantilla de silicona (con las mismas dimensiones que la matriz de electrodos) en la ubicación de espejo en el ojo de control como el implante se encuentra en el ojo implantado (NB la esclerótica translúcido y las marcas de tinte de paso 2.2 permitir la visualización fácil de la posición de matriz implantada ). </li><li> Realice los pasos 2,2 y 2,3 para el ojo de control, de manera que cada sitio electrodo implantado tiene un par de control en una localización anatómicamente comparables (es decir, espejo emparejado equivalente). </li></ol> 3. La disección y la incrustación <ol><li> Retire la matriz de implante del ojo y retirar la parte frontal del ojo(Incluyendo la córnea, el iris y el cristalino). Quitar el humor vítreo del ojo taza restante (cámara posterior). </li><li> Diseccionar el ojo implantado en múltiples tiras representativas (~ 2 mm de espesor) conteniendo cada uno un subconjunto de las regiones marcadas de tinte (Figura 3D). Tenga en cuenta que la orientación de las tiras debería ser seleccionado para ayudar en la evaluación de varios aspectos de la respuesta del tejido al implante 7. </li></ol> Es útil, para futura referencia, para hacer un registro de qué regiones colorantes están presentes en cada banda y sus ubicaciones relativas (y colores). <ol start="3"><li> Coloque la tira en su lado en una piscina de poca profundidad de agar licuado (4%, el 80 - 90 ° C) con el lado a cortar primera orientada hacia abajo (Figura 3E). </li><li> Una vez que el agar se ha fijado, corte alrededor de la muestra y colocar en un contenedor de tejido con el apoyo de piezas de espuma (Figura 3F). </li><li> Repita los pasos 3.1-3.3 para el ojo de control - taking cuidado para diseccionar espejos con ajuste tiras. </li><li> Procesar todos los cassettes de parafina mediante técnica de procesamiento estándar (automático durante la noche). </li><li> Insertar tejido procesado en parafina con el lado a cortar primera orientada hacia abajo. </li></ol> 4. Corte y tinción <ol><li> Cortar los bloques de parafina en 5 secciones micras se refieren regularmente a las notas de los pasos 2 y 3. </li><li> Recoger las secciones de cada una de las regiones teñidas y montar en portaobjetos. </li></ol> La región inmediatamente adyacente a cada mancha teñida de la esclerótica ahora se puede evaluar con la confianza de que era en la proximidad más cercana al electrodo correspondiente de la matriz (Figura 4). <ol start="3"><li> Manchas o realizar inmunofluorescencia si lo deseas. Ejemplo manchas e inmunohistoquímica se muestra en la Figura 5 son: H &amp; E, Luxol azul rápido (LFB); cresil violeta, azul tricrómico de Masson, ácido periódico de Schiff (PAS); Perls azul de Prusia staen; anti-glutamina sintetasa (GS); anti-proteína de neurofilamentos (NF), anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI). </li><li> Manchas estándar y especiales se llevaron a cabo como se detalla: <ol><li> Tinción H &amp; E se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo proporcionado por Leica Multistainer baño de matriz ST5020 (Leica Biosystems). </li><li> Violeta LFB y cresilo (modificado de 11): <ol><li> Desparafinación en 3 cambios de xileno (3 x 2 min) y 2 cambios de etanol (100%, 100%) (2x 1 min) y enjuague en agua del grifo (45 seg). </li><li> Secciones Hidratación a etanol al 95%. </li><li> Colocar en solución LFB 11 a 37 a 42 ° C (durante la noche). </li><li> Enjuague el exceso de tinción con etanol al 70%. </li><li> Enjuague con agua destilada. </li><li> Colocar en carbonato de litio diluido (8%) (pocos segundos). </li><li> Diferenciar en 70% de etanol (pocos segundos). </li><li> Enjuague con agua destilada. </li><li> Repita los pasos 4.4.2.6 a 4.4.2.8, si es necesario, hasta bntecedentes es incoloro. </li><li> Colocar en cresil violeta acetato solución de trabajo a 37 ° C (10 min). </li><li> No lave en agua. </li><li> Deshidratar en 3 cambios de alcohol absoluto (1x 30 sec, 20 sec 2x) y 3 cambios de xileno (1x 1 min 30 s, 2 x 1 min). </li><li> Montar y cubreobjetos con DPX. </li></ol></li><li> Azul tricrómico de Masson (modificado de 11): <ol><li> Desparafinación como por 4.4.2.1. </li><li> Junte las dos secciones al agua (2 min). </li><li> Teñir los núcleos utilizando hierro hematoxilina de Weigert (2 min). </li><li> Lavar en agua corriente, enjuague en agua destilada. </li><li> Teñir en solución de fucsina ácida-escarlata de Biebrich (5 min). </li><li> Enjuague con agua destilada. </li><li> Diferenciar en ácido fosfo-fosfowolfrámico hasta que el colágeno es de color rosa pálido (6 min). </li><li> Enjuague con agua destilada. </li><li> Contratinción de azul de anilina (1 min). </li><li> Lavar bien en ácido acético al 1% (1 min). </li><li> Deshidratar, montaje y cubreobjetos como per 4.4.2.12 y 4.4.2.13. </li></ol></li><li> PAS (modificado de 11): <ol><li> Desparafinación como por 4.4.2.1. </li><li> Oxida en ácido periódico 1% (15 min). </li><li> Lavar en agua corriente del agua y luego destilada. </li><li> Teñir con el reactivo de Schiff (15 min). </li><li> Lave en agua (5 min). </li><li> Contratinción con hematoxilina de Harris (1 min). </li><li> Lavar brevemente en agua del grifo. </li><li> Diferenciar en alcohol ácido al 0,5% (1 dip). </li><li> Lave bien con agua del grifo. </li><li> Azul en el agua del grifo de Scott (1 min). </li><li> Lave bien con agua. </li><li> Deshidratar, montaje y cubreobjetos según 4.4.2.12 y 4.4.2.13. </li></ol></li><li> Perls azul de Prusia mancha como se describe en 11. </li></ol></li><li> La tinción de inmunofluorescencia se realizó como se detalla: <ol><li> Desparafinación como por 4.4.2.1. </li><li> Enjuague con agua destilada (2 x 5 min). </li><li> Realizar la recuperación de antígenos usando tampón de citrato 0,01%, pH de 6 a 75 - 80 ° C (20 min) unad dejar enfriar en una solución tampón de citrato 0,01% (20 min). </li><li> Lavado de las secciones en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (2x 5 min). </li><li> Permeabilizar la membrana celular en solución tampón de lavado (10 min). </li><li> Incubar en solución de bloqueo de suero (2 hr). </li><li> Incubar las secciones de un único anticuerpo primario diluido en diluyente de anticuerpos (10% de cabra normal serum/0.1% Triton X-100/PBS) (por la noche en la nevera). El título de cada anticuerpo primario usado se muestra en la Tabla 1. </li><li> Después de la incubación durante la noche, lavar las secciones en solución de tampón de lavado (5x 3 min). A partir de ahora, mantener las secciones en la oscuridad. </li><li> Incubar las secciones en el anticuerpo secundario correspondiente a un título de 1:500 para una duración específica (véase la Tabla 1 para más detalles). </li><li> Lavar las secciones en solución de tampón de lavado (3 veces 5 min). </li><li> Incubar las secciones en DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min). </li><li> Lavar las secciones en solución de tampón de lavado (3 veces 5 min). </li><li> Montar y cubreobjetos utilizando fluorescamedios de montaje NT. </li></ol></li></ol> Las muestras de ensayo y muestras de control están listos para la comparación por pares.

<ol>
	<li>Santos, A., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Villalobos, J., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+approach+for+a+wide-view+suprachoroidal+retinal+prosthesis:+evaluation+of+implantation+trauma.">Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).</li><li>Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+testes+and+eyes+using+a+modified+Davidson's+fluid:+comparison+with+Bouin's+fluid+and+conventional+Davidson's+fluid.">Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid.</a> Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).</li><li>Agrawal, R. N., He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+proliferative+vitreoretinopathy.">In vivo models of proliferative vitreoretinopathy.</a> Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Horobin, R. W., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Troubleshooting histology stains. , (1998).</li><li>Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamante+in+some+retinal+neurons+is+derived+solely+from+glia.">Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia.</a> Neuroscience. 60, 355-366 (1994).</li><li>Lewis, S. E., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phosphorylated+variants+of+the+high+molecular+mass+subunit+of+neurofilaments+in+axons+of+retinal+cell+neurons:+characterization+and+evidence+for+their+differential+association+with+stationary+and+moving+neurofilaments.">Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments.</a> J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).</li><li>Ruiz-Ederra, J., Garc&#237;a, M., Hicks, D., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+three+neurofilament+subunits+within+pig+and+human+retinal+ganglion+cells.">Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells.</a> Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).</li><li>Bringmann, A., Pannicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).</li><li>Seo, J. M., Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+polyimide+microelectrode+array+for+retinal+stimulation.">Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).</li><li>Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+implantation+of+epiretinal+retina+implants+(EPI-RET)+with+an+IOL-type+receiver+unit.">Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit.</a> J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).</li><li>Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Pardue, M. T., Stubbs, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+studies+of+the+retina+following+long-term+implantation+with+subretinal+microphotodiode+arrays.">Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays.</a> Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).</li><li>Gekeler, F., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+subretinal+prostheses+with+extra-ocular+parts+designed+for+human+trials:+successful+long-term+implantation+in+pigs.">Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).</li><li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs.">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li><li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs.">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li><li>Ray, A., Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+retinal+neurons+under+electrical+stimulation.">Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation.</a> Brain Res. 1255, 89-97 (2009).</li><li>Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+suprachoroidal-transretinal+stimulation+current+resulting+in+retinal+damage+in+rabbits.">Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits.</a> J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).</li><li>Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+chronically+stimulated+platinum+intracochlear+electrodes.">Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes.</a> Biomaterials. 6, 237-242 (1985).</li><li>Villalobos Villa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis. , (2012).</li><li>Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pre-Clinical+Model+for+Chronic+Electrical+Stimulation+of+the+Retina+via+Suprachoroidal+Electrodes.">A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes.</a> , (2012).</li><li>Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis+is+Safe+in+a+Chronic+Implantation+Model.">A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model.</a> in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. , (2011).</li><li>Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+cortex+responses+to+suprachoroidal+electrical+stimulation+of+the+retina:+effects+of+electrode+return+configuration.">Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration.</a> J. Neural Eng. 9, 036009 (2012).</li><li>Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+implantable+microelectrode+arrays+by+laser+cutting+of+silicone+rubber+and+platinum+foil.">Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil.</a> J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).</li><li>Morimoto, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+implantation+of+newly+developed+suprachoroidal-transretinal+stimulation+prosthesis+in+dogs.">Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).</li><li>Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wolff's anatomy of the eye and orbit. , (2001).</li><li>Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+coverage+of+beta+cells+in+the+cat+retina.">Distribution and coverage of beta cells in the cat retina.</a> J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).</li><li>Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychophysical+evaluation+for+visual+prosthesis.">Psychophysical evaluation for visual prosthesis.</a> Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).</li></ol>

Los autores tienen nada que revelar.

La evaluación de la seguridad del implante es una consideración primordial para los estudios preclínicos. Antes de una prótesis retiniana se puede implantar en los seres humanos es esencial para verificar que no causará ningún daño. Esto requiere una evaluación tanto de la biocompatibilidad del implante 17-23, así como cualquier daño potencial que podría ser causado por la estimulación eléctrica crónica 24-26. La experiencia con prótesis neurales similares, como el implante coclear, da una idea de la amplia gama de estimulación y los parámetros físicos, que no causan daño a los tejidos 27. Sin embargo, la retina tiene características diferentes a otros lugares de implantación y los límites de seguridad por lo tanto, precisos (tales como la densidad de carga máxima) no se puede suponer a partir de estudios anteriores en otros sistemas. Densidades de carga son más altos en las zonas de los electrodos activos y esto se corresponde con el mayor potencial de daño. Por lo tanto un método para localizar el tejido directamente adyacentea los electrodos activos individuales aumentaría en gran medida la utilidad de estos estudios. El tejido adyacente a regiones específicas del implante también puede resaltarse para una inspección más cercana. Este enfoque dirigido permite un menor número de secciones que se deben analizar, mientras que la confianza de retención que se examinó el &quot;peor escenario&quot;. El método de localización tinte escleral descrito aquí ha sido ampliamente probado con forma de mano y moldeado de silicona / matrices de electrodos Pt 28-30. Se ha utilizado con película delgada de poliamida arrays 7,31 y también matrices de película delgada de silicona / Pt 32. Algunos estudios prótesis retinales emplean electrodos en forma de &quot;bala&quot; con implantaciones intraesclerales 33. La presente técnica debe ser eficaz para la evaluación de este tipo de conjuntos de electrodos. Ojos felinos con esclerótica delgada (espesor en polo posterior 90 a 200 micras) permite la visualización de los electrodos individuales en una matriz. Sin embargo, incluso si electro personades no eran visibles, sus posiciones se podrían inferirse fácilmente utilizando una plantilla de silicona cuando el contorno de la matriz puede ser visto (similar a la utilizada en el paso 2.6). El mapeo de tinte limita la necesidad de obtener secciones de tejido no relevantes como se obtienen sólo las secciones con el colorante presente. La capacidad de inferir con precisión la posición del electrodo no sólo permite el análisis histopatológico correspondiente y un mayor poder estadístico, pero tiene un gran impacto en el tiempo y la gestión de costes mediante la reducción de la cantidad de diapositivas y hojas utilizadas, así como el costo de mano de obra. El uso de un colorante que es adherente y puede soportar el procesamiento de tejido, mientras que también es visible en secciones de tejido teñidas es una importante consideración inicial. El conocimiento de la ubicación del colorante y la orientación del tejido en la disección y durante la incrustación de ayuda en el proceso de corte. Esto incluye orientar correctamente el bloque para lograr una sección que no está cortado oblicuamente y da una representati completaen el tejido. Por lo tanto, es importante que la persona que realiza el corte está presente en el momento de la aplicación del colorante, la disección y la incrustación. El protocolo general es robusto a menor alteración, particularmente con tiempos de fijación. Sin embargo, la disección de los ojos y los pasos de marcado tinte son procedimientos delicados que se benefician de una buena destreza manual para evitar daños en la muestra. Mientras que el fijador de Davidson ha demostrado ser eficaz para reducir los artefactos de desprendimiento de la retina cerca de un implante, que no impide el daño mecánico directo durante la disección. Fijador de Davidson no era fácilmente compatible con algunos procedimientos histológicos e inmunohistoquímicos especiales. Por lo tanto, había una necesidad de modificar / optimizar estos pasos como se detalló anteriormente. Cambios incrementales en los tiempos de tinción y las concentraciones se realizaron hasta que se logró un resultado óptimo - para más detalles, consulte el material complementario. La cuantificación de la retinahistología sigue siendo problemática. La retina es no homogénea y tanto el espesor y el cambio de densidad celular al aumentar la distancia de la zona de 34,35 centralis. Por lo tanto, los tejidos vecinos dentro del ojo implantado no se puede utilizar para las comparaciones y un ojo de control se emplea en su lugar. Pares a juego de cada sección con el ojo de control nos da una más potente comparación estadística de los cambios patológicos, eficacia y seguridad los resultados con prótesis de retina son mejor evaluadas al comparar los compañeros de los ojos en un objeto 36. Especial cuidado se debe tomar para minimizar el corte oblicuo, lo cual afectaría la cuantificación. En resumen, los métodos descritos anteriormente han mejorado significativamente nuestro análisis histopatológico, que a su vez ha conducido a un flujo de trabajo preclínico más eficiente. Los resultados de los estudios preclínicos utilizando estos métodos llevaron directamente a un ensayo clínico en el que 3 pacientes con RP se han implantado de manera segura con suprachoroiprótesis retinales dal. Estos métodos son relevantes tanto para estimuladores de retina y otros implantes oculares donde la respuesta patológica a la implantación a largo plazo debe ser evaluado. Este método ofrece ventajas valiosas para el mantenimiento de la citoarquitectura y registro de la patología de las regiones de interés en el implante. Aunque no se ha probado específicamente, una modificación de estos procedimientos puede ser utilizado en otras especies y otras localizaciones anatómicas, en particular cuando una matriz se implanta superficialmente.

Prótesis de retina puede convertirse pronto en intervenciones clínicas útiles para el tratamiento de varias formas de pérdida grave de la visión. Ciertas condiciones, tales como retinitis pigmentosa (RP), resultado de la degeneración generalizada de los fotorreceptores en el ojo, que son las células responsables de la transducción de la luz en señales nerviosas. Sin embargo, algunas células en otras capas de la retina se mantienen y son objetivos potenciales para la estimulación eléctrica con una prótesis retiniana 1. Los primeros resultados de los ensayos clínicos en humanos han sido prometedores para las matrices de electrodos implantados en el epiretinal 2,3, 4,5 subretiniano y intraesclerales 6 lugares. Estos dispositivos están hechos de diferentes materiales con diferentes formas, pero todos ellos utilizan impulsos eléctricos para activar las neuronas viables restantes de la retina con el fin de crear percepciones visuales. Nuestro grupo más amplio (Bionic Vision Australia) ha desarrollado un implante de retina que tiene progressed de un estudio clínico piloto con pacientes con RP 3 implantados con conjuntos de electrodos supracoroidea (Clinical Trial Número: NCT01603576). Figura 1A muestra este prototipo supracoroidea prótesis retinal. La seguridad del paciente es de suma importancia en los estudios clínicos y por lo tanto, antes de comenzar los ensayos en humanos, se realizó extensas pruebas aguda y crónica en modelos preclínicos (Figura 1B). Evaluaciones histopatológicas fueron esenciales para refinar los procedimientos quirúrgicos, iterar a través de diseño de los electrodos, y en última instancia, establecer la seguridad del implante. Para mantener un flujo de trabajo eficiente encajaba con las prácticas de patología clínica estándar, se empleó una técnica de inclusión en parafina. También era deseable utilizar procedimientos de tinción comparables con las normas clínicas, tales como hematoxilina y eosina (H &amp; E), que son interpretados fácilmente por los patólogos. También queríamos una técnica que podría ser adaptado para los análisis inmunohistoquímicos, ena fin de facilitar una evaluación adicional celular de los tejidos. La biocompatibilidad de los materiales de implante, y la seguridad de la estimulación eléctrica crónica, es necesario evaluar con cuidado. Es importante ser capaz de examinar la histopatología del tejido ocular adyacente a los electrodos de estimulación individuales dentro de la matriz. Sin embargo, las matrices necesarias para ser eliminado antes de procesar las muestras de forma que pueden ser probados, y debido a que sus componentes metálicos no podían ser fácilmente seccionada. Por consiguiente, nuestra preparación del tejido establecida no permitió la localización y mapeo del tejido con respecto a los electrodos implantados 7. Además de la falta de un método de localización de tejido, la fijación a base de formaldehído estándar y técnicas de procesamiento como resultado artefactos generalizadas y desprendimiento de la retina debido a la contracción diferencial de las diversas capas del ojo (Figura 2). Debido a la falta de homogeneidad de tque la retina, que era difícil hacer comparaciones válidas con tejido de control, en particular para mediciones cuantitativas. Estas limitaciones combinados complicadas evaluaciones precisas de los posibles daños causados ​​por nuestros arrays implantados. Aquí presentamos nuevas técnicas para superar estas limitaciones. Hemos modificado las técnicas especializadas de fijación y procesamiento de los ojos 8-10 para mantener la compatibilidad con la histología a base de parafina. Hemos modificado tinciones histológicas e inmunohistoquímicas estándar para dar resultados comparables, según los comentarios de los patólogos clínicos. Después de hacer que el tejido de la esclerótica translúcida, un código de color basadas en colorantes se emplean para marcar el tejido ocular adyacente a cada electrodo individual, antes de retirar el conjunto del espacio supracoroidea. Al marcar la matriz de electrodos y los sitios de los electrodos individuales, las muestras podrían ser recogidos con precisión a partir de las regiones adyacentes de electrodos. Muestras apareadas podían conseguirse en thojo de control electrónico con el fin de facilitar las comparaciones por pares.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Davidson marking system</td>
			<td>Bradley Products</td>
			<td>1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1500, overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB302</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0142</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:25,000 30 min incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost 90&#176; yellow</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>SF41299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEX IHC Microscope Slides</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>10% serum/0.1% Triton X-100/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
 			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Non-Standard Solution Preparation for Special Stains
			1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
			<ul>
				<li>Cresyl violet 1 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Cresyl Violet Acetate Working Solution
			<ul>
				<li>1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml</li>
				<li>Distilled water 51 ml</li>
				<li>10% acetic acid 0.5 ml</li>
			</ul>
			Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
			<ul>
				<li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li>
				<li>1% acid fuchsin 10 ml</li>
				<li>Glacial acetic acid 1 ml</li>
			</ul>
			Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
			<ul>
				<li>Phosphomolybdic acid 2.5 g</li>
				<li>Phosphotungstic acid 2.5 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Aniline Blue Solution
			<ul>
				<li>Aniline blue 2.5 g</li>
				<li>Glacial acetic acid 2 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Solutions for Immunohistochemistry
			Wash Buffer Solution
			<ul>
				<li>0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS)</li>
			</ul>
			Serum Block Solution
			<ul>
				<li>10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li>
			</ul>
			SUPPLEMENTARY MATERIAL
			Luxol Fast Blue
			The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml.
			Periodic Acid Schiff
			The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining.
			Masson&#8217;s Trichrome Blue
			The principle of the Masson&#39;s trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson&#39;s fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required.
			Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody
			Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and M&#252;ller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da.
			Neurofilament-200 antibody
			Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons.
			Glutamine Synthetase (GS) antibody
			Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of M&#252;ller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis

Con el reciente desarrollo de prótesis de retina, es importante desarrollar técnicas fiables para evaluar la seguridad de estos dispositivos en los estudios preclínicos. Sin embargo, la fijación estándar, la preparación, y procedimientos de histología automatizados no son ideales. Aquí se describen nuevos procedimientos para la evaluación de la salud de la retina directamente adyacente a un implante. Prótesis de retina incluyen matrices de electrodos en contacto con el tejido ocular. Los métodos anteriores no han sido capaces de localizar espacialmente el tejido ocular adyacente a los electrodos individuales dentro de la matriz. Además, el procesamiento histológico estándar a menudo resulta en desprendimiento artefactual bruto de las capas de la retina cuando la evaluación de los ojos implantados. En consecuencia, ha sido difícil evaluar daños localizados, si está presente, causada por la implantación y la estimulación de un conjunto de electrodos implantados. Por lo tanto, hemos desarrollado un método para la identificación y la localización del tejido ocular adyacente a e implantadolectrodes utilizando un esquema de marcado tinte (código de color), y modificado una técnica de fijación de los ojos para minimizar el desprendimiento de retina artefactos. Este método también dictó la esclerótica translúcida, lo que permite la localización de los electrodos individuales y partes específicas de un implante. Por último, se utilizó un control emparejado para aumentar la potencia de las evaluaciones histopatológicas. En resumen, este método permite la discriminación fiable y eficaz y la evaluación de la citoarquitectura retina en un ojo implantado.

La figura 4 muestra una sección representativa resultante de cortar la muestra representada en la Figura 3. La sección se corta a 5 m de espesor y se tiñeron con H &amp; E de acuerdo a los protocolos descritos anteriormente. La forma grave de la tira de muestra se conserva con artefactos tejidos diferenciales mínimos (Figura 4A). Ambas marcas de colorante eran visibles en la esclerótica, aunque el tinte verde era más resistente que el rojo (Figura 4B). Las capas de la retina no fueron artificialmente separadas y la morfología de la retina se conserva (Figura 4C). El tejido de la retina adyacente a las marcas de colorante, lo que corresponde a la ubicación de los electrodos en la matriz, puede ser fácilmente identificada. La Figura 5 muestra la tinción inmunohistoquímica y representante especial de las secciones de tejido preparados de acuerdo con el protocolo actual. Consulte la Figura 5 Caption y materiales complementarios para obtener más detalles sobre las manchas específicas y las modificaciones que se hagan a su uso. Después de la modificación, las manchas y la inmunohistoquímica son equivalentes a las normas establecidas - como se verifica por los patólogos. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de anticuerpo primario y título (entre paréntesis) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> Tipo de anticuerpo secundario y título (entre paréntesis) </td><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Alexa Fluor 488 </td></tr><tr><td> Duración de la incubación de anticuerpo secundario </td><td> 1 hr </td><td> 2 hr </td><td> 45 min </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tipo de anticuerpos, Titre y duración de etiquetado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> Figura 1. Suprachoroidal de electrodos Prototype. A) Fotografía macro de una matriz de moldeado grado clínico. B) Microfotografía de un conjunto preclínico hecho a mano. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> Figura 2. El ex Histología de retina. Métodos histológicos estándar se utilizaron para preparar estos, H &amp; E manchadas, secciones de un ojo implantado con una matriz de electrodos supracoroidal. A) Una sección ortogonal a través de la cavidad de matriz de electrodos (representado por una estrella). La retina se separa del tejido ocular externa. Esto es particularmente evidente por debajo de la región implantada (flecha). Es imposible determinar qué porción de la retina era adyacente a cada electrodo individual de la matriz. Barra de escala = 1 mm. B) Un aumento mayor de la región en caja en el panel A. Hay varios, regularmente espaciadas, artefactos en la laye retinars (flechas), así como gran desprendimiento de la capa de tapetum (la capa reflectante en los ojos felino). Barra de escala = 100 micras. C) Un aumento mayor de la región en caja en el panel B. Flecha indica los segmentos externos de los fotorreceptores, así como el epitelio pigmentaria, que permanecen intactos, lo que sugiere que el desprendimiento era un artefacto efecto secundario del tratamiento, en lugar de ser causado por un traumatismo en vivo o patología. Barra de escala = 20 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> Figura 3. Localización y disección de electrodo-tejido adyacente. AD) High Dynamic macro fotografías alcance de un ojo enucleado, con una serie de electrodos supracoroidea in situ. A) Colocar fijadas con fijador de Davidson, y antes de la eliminación de matriz, la esclerótica translúcida permite la visualización delos electrodos individuales en la matriz (solo ejemplo se indica con la flecha). B) Los electrodos están marcados con un tinte de color predefinido. C) marcas Dye a espaciamiento regular de puntos de referencia anatómicos se utilizan para mantener la consistencia a través de experimentos. D) Tras la eliminación del matriz, el ojo se disecciona a mano en tiras de muestra. Flechas de colores indican dos de los sitios adyacentes de los electrodos en la esclerótica. Línea discontinua amarilla indica plano de corte. E) Macro-fotografía de tira de muestra incrustado en un bloque de agar. F) Macro fotografía de la tira de muestra agar-embed del Grupo E, cortado y colocado en un casete de incorporación con el apoyo de espuma almohadillas biopsia para minimizar el movimiento de la sección durante el procesamiento. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> La Figura 4. Nueva Histología Retina. </s<html> trong&gt; La tira de muestra anterior (de la Figura 3D), que contiene el bolsillo electrodo, era embebidos en parafina, se seccionaron a 5 micras y se tiñeron con H &amp; E. A) verde y las regiones teñidas de rojo (indicada por las flechas, lo mismo que la Figura 3D) son visibles en una sección tomada en el nivel de la línea de trazos de color amarillo en la Figura 3D. Barra de escala = 1,000 micras. La retina no se desprende, ni debajo del bolsillo array ni remotamente. B) La región en caja de Grupo A con tinte rojo y verde visible indicado por las flechas, y la retina intacta en todas partes. Barra de escala = 500 micras. C) de la región en caja del Grupo B, que muestra la intacta, que se adjunta, la retina adyacente al tinte verde. Barra de escala = 50 micras. Sabiendo que la ubicación del colorante indica la posición de un electrodo, podemos con toda confianza evaluar el tejido de la retina adyacente de los daños, si los hubiere, causada por la estimulación eléctrica. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplos de cytohistochemistry retina modificado usando tinciones especiales e inmunofluorescencia. El uso de fijador de Davidson, en contraposición con las técnicas estándar de fijación de formalina, alteraciones necesarias a los protocolos de tinción habituales, como se indica en el texto principal protocolo. Los patólogos han confirmado que estas modificaciones resultaron en tinción equivalente. A) H &amp;E; hematoxilina manchas púrpura núcleos de las células, mientras que eosina manchas citoplasma de la célula, de colágeno y de apoyo de tejido varios tonos de color rosa. B) LFB mielina manchas azules, mientras que la tinción de contraste violeta de cresilo se puede utilizar para . identificar las células ganglionares de la tinción cuerpos de Nissl en el azul pericarión y destacando las células satélites que rodean las células C) azul tricrómico de Masson, la Biebrich scarlet-fucsina ácida solución manchas muscular fibros rojo, mientras que las manchas de azul de anilina del colágeno, en este caso, la esclerótica, azul D) PAS;. componentes glicoproteína de la membrana basal y componentes del tejido conectivo se tiñen de color púrpura, mientras que la contratinción de hematoxilina celular núcleos púrpura E) Perls azul de Prusia.; en el lugar de la hemorragia, la formación de hemosiderina degradadas a partir de células rojas de la sangre y la liberación de complejos de hierro produce un color púrpura, mientras que la adición de colores neutros tiñen de rojo lisosomas rojo F) GS;. este neurotransmisor enzima degradante que se encuentra en las células de Müller 13 (verde ), se puede observar que se extiende en ambas direcciones con los cuerpos de las células de Müller en la capa nuclear interna y Müller endfeet células que forman la membrana limitante interna G) NF-200,. esta pesada cadena de proteínas del citoesqueleto (verde) se encuentra en el soma celular y los procesos de , enlaces cruzados con otros neurofilamentos para mantener la estructura de las neuronas 14,15. Gangliolas células y sus axones se pueden ver en la capa de células ganglionares y de la capa de fibras nerviosas, mientras que los axones de las células horizontales situados en la frontera exterior de la capa nuclear interna en la retina felino, también se ponen de relieve. Contratinción con DAPI (azul) permite la visualización de capas de la retina H) GFAP;. Esta proteína del citoesqueleto (rojo) proliferaron en las células de Müller y astrocitos durante gliosis 16, se puede ver que recubre la capa de fibras nerviosas con las células de Müller formando extensiones finas a través del interior de las capas externas de la retina. Contratinción con DAPI (azul) permite la visualización de las capas de la retina. Barra de escala = 50 micras en todos los paneles. La retina interna se muestra en la parte superior de cada imagen; la retina externa se muestra en la parte inferior de cada imagen, excluyendo Grupo E, que muestra la reacción subescleral.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis at JoVE.com

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Técnicas para la visualización de la retina citoarquitectura directamente adyacente a los electrodos individuales dentro de un estimulador de la retina.

Técnicas de Procesamiento de ojos implantados con una prótesis de retina para el análisis histopatológico localizada

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K vistas.  Bionics Institute. Técnicas para la visualización de la retina citoarquitectura directamente adyacente a los electrodos individuales dentro de un estimulador de la retina.

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Cómo medir plegable cortical a partir de imágenes MR: un tutorial paso a paso para Calcular Índice Gyrification Local

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Investigación

Medicina

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Procesamiento de mamoplastia de reducción y tejidos humanos Mastectomía para el cultivo celular

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Las técnicas para Ojos Procesamiento implantados con una retina Prótesis para análisis histopatológico localizado: Parte 2 Epirretinal Implantes de retina con tachuelas

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un Paso a Paso Protocolo para la cirugía subretiniana en conejos

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Customizing a Cryolite Glass Prosthetic Eye

In Germany, Austria, and Switzerland, over 90% of ocularists still manufacture customized prostheses using cryolite glass from Thuringia. The present manuscript demonstrates this long-forgotten technique in detail. This manuscript shows some major advantages of manufacturing prosthetic eyes using cryolite glass in comparison to poly(methyl methacrylate) (PMMA). These advantages include a lighter weight of the prosthesis, higher levels of patient satisfaction, and only one appointment necessary for the customized manufacturing. Potential risk of breakage seems not to be a critical disadvantage for glass prosthetic eye wearers. However, in some patients, manufacturing a well-fitting prosthetic eye is not possible or reasonable due to anophthalmic socket complications such as post nucleation socket syndrome, scarred fornices, or an orbital implant exposure. This article gives ophthalmologists a better insight into ocularistic care in order to improve the essential interprofessional collaboration between ocularists and ophthalmologists.

This manuscript shows each step of customizing a cryolite glass prosthetic eye including some major advantages of the use of cryolite glass for manufacturing an eye prosthesis compared to poly(methyl methacrylate). In addition, this manuscript gives ophthalmologists better insight into the ocularistic care that could improve interprofessional collaboration.

Personalización de un ojo protésico de vidrio criolita

In Germany, Austria, and Switzerland, over 90% of ocularists still manufacture customized prostheses using cryolite glass from Thuringia. The present ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Un método para la optimización del proceso de Zanba-Splay-Sprayi Tiebangchui

Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method

The dried root of Aconitum pendulum Busch., called Tiebangchui (TBC) in Chinese, is one of the most famous Tibetan medicines. It is a widely used herb in northwest China. However, many cases of poisoning have occurred because of TBC's intense toxicity and because its therapeutic and toxic doses are similar. Therefore, finding a safe and effective method to reduce its toxicity is an urgent task. A search through the Tibetan medicine classics shows that the processing method of TBC stir-fried with Zanba was recorded in the "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)". However, the specific processing parameters are not yet clear. Thus, this study aims to optimize and standardize the processing technology of Zanba-stir-fried TBC.
First, a single-factor experiment was conducted on four factors: the slice thickness of TBC, amount of Zanba, processing temperature, and time. With monoester and diester alkaloid contents in Zanba-stir-fried TBC as indexes, CRITIC combined with the Box-Behnken response surface method was used to optimize the processing technology of Zanba-stir-fried TBC. The optimized processing conditions of Zanba-stir-fried TBC were a TBC slice thickness of 2 cm, three times more Zanba than TBC, a processing temperature of 125 &#176;C, and 60 min of stir-frying. This study determined the optimized and standard processing conditions for the usage of Zanba-stir-fried TBC, thus providing an experimental basis for the safe clinical use and industrial production of Zanba-stir-fried TBC.

Autor destacado: Optimización de la tecnología de procesamiento para Tiebangchui con Zanba basada en CRITIC combinada con el método de superficie de respuesta Box-Behnken  

The present protocol describes an efficient and standard detoxification processing method for Zanba-stir-fried Tiebangchui using CRITIC combined with the Box-Behnken response surface method.

Optimización de la tecnología de procesamiento para Tiebangchui con Zanba basada en CRITIC combinada con el método de superficie de respuesta Box-Behnken

The dried root of Aconitum pendulum Busch., called Tiebangchui (TBC) in Chinese, is one of the most famous Tibetan medicines. It is a widely used herb in ...