Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones de los NIH: R01EY031596 de subvenciones de los NIH (a C.M.); R01EY029985 de subvención de los NIH (a C.M.); P30EY010572 de subvenciones de los NIH (a C.M.); R01EY032564 de subvención de los NIH (a B.S.). Agradecemos a Tammie Haley por su apoyo técnico en la preparación de secciones de retina, y al Dr. Charles Allen por contribuir generosamente con las sondas FISH de ARNm utilizadas en este trabajo.

Estudio de las células neuronales bipolares y horizontales en la retina dividida murina

<ol>
	<li>Morgans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+ribbon+synapses+in+the+retina.">Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).</li><li>Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+bipolar+cells:+elementary+building+blocks+of+vision.">Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).</li><li>Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Thickness+Normative+Data+in+Wild-Type+Mice+Using+Customized+Miniature+SD-OCT.">Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).</li><li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Protocol+for+Retinal+Wholemount+Preparation+for+Imaging+and+Immunohistochemistry.">Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).</li><li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+in+the+Retina.">Neurotransmitters in the Retina.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).</li><li>Chaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+functional+roles+of+horizontal+cells+in+the+retinal+circuit.">Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).</li><li>Egger, V., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A17+Amacrine+Cells+and+Olfactory+Granule+Cells:+Parallel+Processors+of+Early+Sensory+Information.">A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).</li><li>Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+amacrine+cell.">The dopaminergic amacrine cell.</a> The Journal of Comparative Neurology. 301 (3), 461-489 (1990).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connectomic+analysis+reveals+an+interneuron+with+an+integral+role+in+the+retinal+circuit+for+night+vision.">Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision.</a> eLife. 9, 56077 (2020).</li><li>Janssen-Bienhold, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin57+is+expressed+in+dendro-dendritic+and+axo-axonal+gap+junctions+of+mouse+horizontal+cells+and+its+distribution+is+modulated+by+light.">Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+excitation+and+inhibition+in+the+dendrites+of+mouse+direction-selective+ganglion+cells.">The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells.</a> eLife. 9, 52949 (2020).</li><li>Marvin, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+for+in+vivo+imaging+of+GABA.">A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA.</a> Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).</li><li>Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+Proton-Mediated+Inhibitory+Feedback+at+the+Retinal+Horizontal+Cell-Cone+Synapse+with+Genetically-Encoded+pH+Probes.">Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).</li></ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Después de que los fotorreceptores transducen la absorción de fotones en liberación de neurotransmisores, las BC y HC son las primeras neuronas de la retina en procesar la señal visual23. Si bien la importancia de estas neuronas es bien apreciada, muchas de sus funciones no se comprenden completamente o no se exploran por completo. Es probable que muchos estudios de fisiología de BC y HC se beneficien de una preparación de retina de montaje plano que mejore el acceso a las neuronas INL al tiempo que preserva la conectividad lateral. El desarrollo del método de retina dividida representa un esfuerzo por proporcionar un protocolo sencillo para adquirir registros electrofisiológicos de alta calidad y datos de microscopía de BC y HC en una orientación de montaje plano. La preparación de la retina dividida descrita aquí se puede realizar en aproximadamente 20 minutos por ratón (10 minutos por retina) después del aislamiento de la retina, sin el uso de equipos especializados. El método se inspira en los procedimientos de eliminación de fotorreceptores existentes, pero ofrece mejoras significativas en simplicidad, velocidad y versatilidad 4,10,11,12,13. A diferencia de los métodos anteriores para separar las capas de la retina, la división de la retina no requiere congelación, liofilización o aplicación repetida de adhesivos a la retina. Con la práctica, casi todos los fotorreceptores se pueden eliminar de una sola vez con la membrana de nitrocelulosa. La velocidad y facilidad de este enfoque permite minimizar el tiempo que la retina pasa fuera de Ames carbogenados, lo que permite una alta viabilidad celular durante largos períodos; Las retinas divididas se pueden mantener en medios Ames carbogenados durante varias horas después de la división. Como testimonio de la salud de las neuronas INL en esta preparación, una tinción de células vivas/muertas (Figura 4) y la electrofisiología de patch-clamp (Figura 6) confirman la viabilidad de los glóbulos rojos y los HC después de una división.
La eliminación de la capa fotorreceptora en las retinas divididas supone una ventaja significativa durante el inmunomarcaje al reducir drásticamente el tiempo de difusión de los anticuerpos en la INL. El marcaje de anticuerpos primarios y secundarios se puede completar en 2 h, una mejora sustancial con respecto a la tinción convencional de montaje plano, que puede tardar 72 h o más, dependiendo del objetivo 5,6,7,8,20,22. Como resultado, los datos de microscopía se pueden adquirir el mismo día que la preparación del tejido, lo que acelera drásticamente el ritmo de los experimentos de inmunofluorescencia. Para facilitar el recocido de la sonda de ARNm, los experimentos FISH suelen recomendar tiempos de fijación mucho más largos (~24 h) que el inmunomarcaje18. Sin embargo, los experimentos presentados aquí demuestran que una fijación de 2 h sigue produciendo un marcaje excepcional de FISH (Figura 5). A pesar de extender el tiempo de fijación de 30 min a 2 h, no fue necesario realizar pasos de recuperación de antígenos para obtener un excelente inmunomarcaje, pero esto puede variar con el anticuerpo o el antígeno. El tratamiento con proteasa en el protocolo FISH puede interferir con el marcaje de anticuerpos, probablemente debido a la destrucción de los epítopos diana. Este problema se evitó mediante el uso de anticuerpos policlonales que se dirigen a múltiples epítopos, lo que disminuye la probabilidad de que la destrucción de los epítopos dificulte el inmunomarcado. Además, se utilizó un tratamiento con proteasa moderada (ACD proteasa III) para prevenir la alteración excesiva del epítopo y, al mismo tiempo, proporcionar una penetración tisular suficiente.
En ocasiones, la retina se divide a través de la capa nuclear externa (ONL), dejando capas de somas fotorreceptores sin células INL visibles. Para evitar esto, uno debe asegurarse de que la retina quede completamente plana sobre el vidrio y que se haya eliminado cualquier líquido residual alrededor de la retina. Presionar con más firmeza sobre la nitrocelulosa con el pincel también puede ayudar a evitar que se parta a través de la ONL. Si la membrana se humedece demasiado o la retina se pliega sobre sí misma, las posibilidades de una división exitosa disminuirán considerablemente. El uso de DAPI para teñir núcleos celulares es útil para evaluar la calidad de la división y para determinar la cobertura de los fotorreceptores restantes. Los núcleos fotorreceptores son más pequeños, más brillantes y más superficiales (Figura suplementaria 3A), mientras que los núcleos BC son más grandes, más tenues y más profundos (Figura suplementaria 3B). En algunos casos, el plano del desgarro variará ligeramente a lo largo de la parte de la retina, lo que dará lugar a parches en los que los cuerpos celulares fotorreceptores no se han eliminado por completo (Figura complementaria 3C). Para aplicaciones en microscopía y electrofisiología, esto no obstaculiza la capacidad de recopilar datos de calidad de regiones donde los fotorreceptores se han eliminado correctamente; Se pueden encontrar fácilmente grandes campos de retina interna expuesta cuando se toman imágenes o se graba con una pipeta de parche. Si se desea una eliminación más completa de los fotorreceptores, se puede realizar un segundo desgarro con una pieza adicional de membrana de nitrocelulosa, aunque no se garantiza la eliminación del 100% de los fotorreceptores. Por lo tanto, se recomienda precaución al utilizar retinas divididas en estudios de expresión génica o proteómica en los que el material fotorreceptor residual podría influir en los resultados. En el caso de las aplicaciones de una sola célula, esta preocupación es injustificada, ya que los datos de los fotorreceptores pueden excluirse del análisis.
Las ventajas de la preparación de la retina dividida son quizás más destacadas en los registros electrofisiológicos de interneuronas de campo amplio. Mientras que los cortes verticales tradicionales cortan los extensos procesos de las células de campo amplio, la preparación de la retina dividida deja intactas la OPL y la IPL, lo que permite capturar la entrada de las células de campo amplio como HC 24, A17s25, TH AC 26 y NOS-1 AC27 que de otro modo se pasarían por alto en los cortes verticales. Por lo tanto, la interpretación de los resultados y la comparación con los datos previos recopilados de cortes de retina requiere una reflexión cuidadosa. Sin embargo, en experimentos que utilizan imitaciones farmacológicas de la estimulación lumínica, estos resultados se asemejan a los datos registrados a partir de cortes de retina19. Al expresar ChR2 bajo promotores específicos de la célula, se puede estimular una población celular deseada mientras se registran los BC en el INL para investigar el impacto de la célula deseada en la vía de información vertical. El registro directo de las neuronas INL más profundas, como las células amacrinas, también es factible en la retina dividida. Si bien en este caso el electrodo de parche debe viajar primero a través de las neuronas INL más superficiales, hay considerablemente menos tejido que obstruye su camino en comparación con una preparación tradicional de montaje completo.
Además de medir la influencia de las células de campo amplio en otras neuronas, este método permite el pinzamiento directo de parches unicelulares a partir de HC, cuyas dendritas forman una extensa red acoplada de unión gap en el OPL28. Las células horizontales envían una retroalimentación crítica a los fotorreceptores, lo que da forma a la transmisión de información vertical a través de la retina. Sin embargo, dado que los campos dendríticos de los HC se truncan en cortes verticales, faltan datos de registro de una sola célula. En este trabajo se presentan HCs anatómica y fisiológicamente intactas a partir de las cuales se registran corrientes evocadas por ChR2 en una línea triple de ratones transgénicos (Figura 6 C-E). Fuera de la estimulación ChR2, la retina dividida se puede utilizar para estudiar las corrientes endógenas de HC y el acoplamiento de la unión gap28. Si bien la retina dividida proporciona un modelo conveniente para estudiar la conectividad sináptica y la actividad neuronal inducida por la aplicación química o la estimulación de ChR2, la falta de fotorreceptores impide cualquier exploración directa de las respuestas naturales a la luz o los mecanismos de adaptación a la luz.
La obtención de imágenes in situ en la retina ha hecho un progreso admirable en los últimos años. Sin embargo, la mayoría de los estudios de imagen se limitan a la capa de células ganglionares en las preparaciones de retina de montaje completo29. Los autores prevén que la ausencia de fotorreceptores en la retina dividida la convertirá en un modelo ideal para obtener imágenes de calcio en vivo en la OPL y la INL. Más allá de las imágenes de calcio, este modelo tiene un gran potencial para su uso con biosensores codificados genéticamente como iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 y pHluorin33. Combinadas con la preparación de la retina dividida, estas poderosas herramientas pueden ofrecer un enfoque eficiente para explorar las interacciones sinápticas y las propiedades biofísicas de los BC y HC que contribuyen al procesamiento de la luz en la retina.

La retina es un tejido neural delgado ubicado en la parte posterior del ojo donde la luz es interceptada y procesada en una señal electroquímica que puede ser interpretada por el cerebro. En la parte posterior de la retina, los fotorreceptores de bastones y conos son estimulados por la luz, lo que reduce la tasa de liberación tónica del neurotransmisor glutamato1. Las primeras neuronas que experimentan y responden a este cambio inducido por la luz en la concentración de glutamato son las células bipolares (BC) y las células horizontales (HC), cuyos somas residen en la región más externa de la capa nuclear interna (INL). Estas neuronas de segundo orden realizan la primera etapa del procesamiento de señales en la retina y dan forma a características críticas de la visión, como la adaptación a la luz, la sensibilidad al contraste y la oponencia espacial/color. Si bien estas funciones se han atribuido a los BC y HC, los circuitos y los mecanismos bioquímicos que subyacen a estos procesos no se comprenden completamente3. Por lo tanto, el avance de herramientas y métodos para explorar la fisiología de la CM y la HC es de suma importancia.
Las secciones verticales (transversales) de la retina han demostrado durante mucho tiempo ser el modelo más práctico para estudiar los BC y HC; sin embargo, ciertos aspectos de la fisiología de BC y HC son inaccesibles para el experimentador bajo este modelo. Los registros directos de las HC o las mediciones indirectas de sus efectos sobre las CC no reflejan la conectividad endógena de la retina, ya que los procesos laterales de estas células se cortan durante el corte. Las preparaciones de retina de montaje completo evitan este problema al preservar estos procesos laterales, pero las capas retinianas circundantes plantean un desafío para acceder aestas células. Si bien hay abundantes ejemplos de inmunotinción 5,6,7,8 y registros de pinza de parche9 de neuronas INL en retinas de montaje completo, existe la oportunidad de acelerar y simplificar la recopilación de estos datos. Por lo tanto, las limitaciones inherentes de las secciones transversales y los desafíos del modelo de montura completa inspiraron el desarrollo de esta preparación alternativa para la retina de montaje plano.
El siguiente trabajo describe un protocolo para eliminar fácilmente la capa fotorreceptora de las retinas vivas de montaje plano para mejorar el acceso a los BC y HC para simplificar el pinzamiento del parche y un inmunomarcaje más rápido y eficiente. Al despegar dos piezas de membrana de nitrocelulosa unidas a cada lado de una retina aislada, se desgarra el tejido a través de los axones fotorreceptores, dejando una retina dividida que retiene la capa plexiforme externa (OPL) y todas las capas internas de la retina. Mientras que otros han descrito protocolos para separar mecánicamente las capas de la retina, estos métodos no son adecuados para aplicaciones de pinzamiento de parches y microscopía o requieren una manipulación tediosa del tejido. Varios de estos métodos requieren tejido congelado o liofilizado para la separación de capas, lo que los hace incompatibles con los experimentos de electrofisiología10,11,12. Otros están diseñados para tejido vivo, pero requieren de 5 a 15 exfoliaciones secuenciales con papel de filtro 4,11 o tratamiento con tripsina 13 para eliminar los fotorreceptores. La técnica descrita aquí mejora sus predecesoras al simplificar el procedimiento de eliminación de fotorreceptores y ampliar el repertorio de aplicaciones posteriores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 pairs of Dumont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470 nm LED</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>M470L2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-306 curved scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; disposable pasteur pipetes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>for constructing custom transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai80d mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>25109</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:025109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium w/L-Glutamate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A1372-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier control software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10.3 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calbindin D28K antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA-5 85669</td>
			<td>RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612044</td>
			<td>RRID:&#160; AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GPR179 antibody</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PKC alpha antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4334</td>
			<td>RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PKC alpha antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc8393 AF594</td>
			<td>RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610495</td>
			<td>RRID:&#160; AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RGS11 antibody</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX;&#160; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin P38 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-S5768</td>
			<td>RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquamount mounting media</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>13800</td>
			<td>slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>000664</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:000664</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbogen tank</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NA</td>
			<td>95% O2 and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom transfer pipette</td>
			<td>custom build</td>
			<td>NA</td>
			<td>Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitical optical power meter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>&#160;PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS, BX50WI</td>
			<td>Dodt gradient contrast microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO CS2 40x/1.3&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO CS2 63x/1.40&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Robbins Scientific</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>for RNAscope protocol only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immedge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe (delicate task wipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 X confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium 15 mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060-60</td>
			<td>eyes are kept here during retina dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merit 97-275 steel scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm-Gabrd-C2 mRNA probe</td>
			<td>ACD</td>
			<td>459481-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse euthanasia chamber</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>custom build; glass petri dish covering a small glass jar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences; Whatman</td>
			<td>7184-005</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>General Valve Corporation</td>
			<td>Picospritzer II&#160;</td>
			<td>referred to in the text as microcellular injection unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>for constructing custom transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-603</td>
			<td>for connection to carbogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum harp</td>
			<td>custom build</td>
			<td>NA</td>
			<td>for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>size 0 paint brush</td>
			<td>generic</td>
			<td>NA</td>
			<td>for flattening retina during splitting.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36937&#160;</td>
			<td>referred to in the text as anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small 10 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>eyes are placed here following enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small glass pane (7.5 cm x 5 cm)</td>
			<td>generic</td>
			<td>NA</td>
			<td>isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>electrostatically-charged glass microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors; straight</td>
			<td>Titan Medical</td>
			<td>TMS121</td>
			<td>not brand specific; any comparable scissors will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGATFLPo mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>29591</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:029591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGlut2Cre mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>28863, 016963</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423105</td>
			<td>referred to in the text as MI-NIR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina

Las células bipolares y las células horizontales de la retina de los vertebrados son las primeras neuronas en procesar la información visual después de que los fotones son detectados por los fotorreceptores. Realizan operaciones fundamentales como la adaptación a la luz, la sensibilidad al contraste y la oposición espacial y de color. Una comprensión completa de los circuitos precisos y los mecanismos bioquímicos que gobiernan su comportamiento hará avanzar la investigación en neurociencia visual y la medicina oftalmológica. Sin embargo, las preparaciones actuales para examinar las células bipolares y horizontales (montajes enteros de la retina y cortes verticales) son limitadas en su capacidad para capturar la anatomía y la fisiología de estas células. En este trabajo, presentamos un método para eliminar cuerpos de células fotorreceptoras de retinas de ratón vivas de montaje plano, proporcionando un mejor acceso a las células bipolares y horizontales para un pinzamiento eficiente del parche y un rápido inmunomarcado. Las retinas divididas se preparan intercalando una retina de ratón aislada entre dos trozos de nitrocelulosa y luego separándolas suavemente. La separación divide la retina justo por encima de la capa plexiforme externa para producir dos piezas de nitrocelulosa, una que contiene los cuerpos celulares fotorreceptores y otra que contiene la retina interna restante. A diferencia de los cortes verticales de retina, la preparación de la retina dividida no corta los procesos dendríticos de las neuronas internas de la retina, lo que permite grabaciones de células bipolares y horizontales que integran las contribuciones de las redes acopladas a uniones gap y las células amacrinas de campo amplio. Este trabajo demuestra la versatilidad de esta preparación para el estudio de células horizontales y bipolares en experimentos de electrofisiología, inmunohistoquímica e hibridación in situ .

The retina is a thin neural tissue located in the posterior eye where light is intercepted and processed into an electrochemical signal that can be interpreted by the brain. At the back of the retina, rod and cone photoreceptors are stimulated by light, which reduces the tonic release rate of the neurotransmitter, glutamate1. The first neurons to experience and respond to this light-induced change in glutamate concentration are the bipolar cells (BCs) and horizontal cells (HCs), whose somas reside in the outermost region of the inner nuclear layer (INL). These second-order neurons perform the first stage of signal processing in the retina and shape critical features of vision such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial/color opponency2. While these functions have been ascribed to BCs and HCs, the circuitry and biochemical mechanisms underlying these processes are not fully understood3. Therefore, the advancement of tools and methods for exploring BC and HC physiology is of paramount importance.
Vertical (transverse) retina sections have long&#160;proven the most practical model for studying BCs and HCs; however, certain aspects of BC and HC physiology are inaccessible to the experimenter under this model. Direct recordings from HCs or indirect measurements of their effects on BCs do not reflect the retina&#39;s endogenous connectivity since the lateral processes of these cells are severed during slicing. Whole mount retina preparations circumvent this issue by preserving these lateral processes, but the surrounding retinal layers pose a challenge for accessing these cells4. While there are abundant examples of immunostaining5,6,7,8 and patch clamp recordings9 from INL neurons in whole mount retinas, there is an opportunity to expedite and simplify the collection of these data. The inherent limitations of transverse sections and the challenges of the whole mount model thus inspired the development of this alternative flatmount retina preparation.
The following work describes a protocol for easily removing the photoreceptor layer from live, flatmount retinas to enhance access to BCs and HCs for simplified patch clamping and faster, more efficient immunolabeling. Peeling apart two pieces of nitrocellulose membrane attached to either side of an isolated retina tears the tissue through the photoreceptor axons, leaving a split retina that retains the outer plexiform layer (OPL) and all inner retinal layers. While others have described protocols for mechanically separating layers of the retina, these methods are either poorly suited to patch clamping and microscopy applications or require tedious manipulation of the tissue. Several of these methods require frozen or lyophilized tissue for layer separation, making them incompatible with electrophysiology experiments10,11,12. Others are designed for live tissue, but necessitate 5-15 sequential peels with filter paper4,11 or treatment with trypsin13 to remove the photoreceptors. The technique described here improves upon its predecessors by simplifying the photoreceptor removal procedure and expanding the repertoire of downstream applications.

Autor destacado: Uso de la técnica de retina dividida para mejorar el acceso y acelerar los experimentos 

Retina dividida como una preparación mejorada de montaje plano para estudiar las neuronas de la capa nuclear interna en la retina de vertebrados

Our group is interested in the neuronal circuitry and synaptic mechanisms underlying visual processing in the retina. The Morgans Lab is investigating molecular mechanisms of light adaptation in bipolar cells, and the Sivyer Lab is interested in how inner retinal neurons contribute to ganglion cell function. Accessing internuclear layer neurons in whole mount retina is a challenge for both anatomical and physiological studies.Internuclear layer neurons are accessible in vertical sections, but they're very few neurons in the field of view. Furthermore, slicing severs lateral processes and connections which can impact physiological studies. The removal of the photoreceptors in the split retina technique dramatically improves antibody diffusion into the inner retina, which makes immunolabeling of inner retinal targets over 20 times faster when compared to traditional whole mount retina.The split retina also greatly improves access to internuclear layer neurons during patch clamp electrophysiology. The split retina technique will open doors to new approaches and accelerate the pace of our experiments. For example, we plan to use this technique to study bipolar cell inputs to melanopsin ganglion cells by expressing channelrhodopsin in the bipolar cells.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Split Retina Technique for Enhanced Access and Accelerated Experiments at JoVE.com

Este trabajo presenta una preparación alternativa de retina de montaje plano en la que la eliminación de los cuerpos de las células fotorreceptoras permite una difusión más rápida de los anticuerpos y un mejor acceso de la pipeta de parche a las neuronas internas de la retina para experimentos de inmunohistoquímica, hibridación in situ y electrofisiología.

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by ...

Nuestro grupo está interesado en los circuitos neuronales y los mecanismos sinápticos que subyacen al procesamiento visual en la retina. El Laboratorio Morgans está investigando los mecanismos moleculares de adaptación a la luz en las células bipolares, y el Laboratorio Sivyer está interesado en cómo las neuronas internas de la retina contribuyen a la función de las células ganglionares. El acceso a las neuronas de la capa internuclear en la retina de montaje completo es un desafío tanto para los estudios anatómicos como para los fisiológicos.Las neuronas de la capa internuclear son accesibles en secciones verticales, pero son muy pocas neuronas en el campo de visión. Además, el corte corta los procesos laterales y las conexiones, lo que puede afectar a los estudios fisiológicos. La eliminación de los fotorreceptores en la técnica de retina dividida mejora drásticamente la difusión de anticuerpos en la retina interna, lo que hace que el inmunomarcaje de los objetivos de la retina interna sea más de 20 veces más rápido en comparación con la retina tradicional de montaje completo.La retina dividida también mejora en gran medida el acceso a las neuronas de la capa internuclear durante la electrofisiología de la pinza del parche. La técnica de la retina dividida abrirá las puertas a nuevos enfoques y acelerará el ritmo de nuestros experimentos. Por ejemplo, planeamos usar esta técnica para estudiar las entradas de células bipolares a las células ganglionares de melanopsina mediante la expresión de canalrodopsina en las células bipolares.

split-retina-as-an-improved-flatmount-preparation-for-studying-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

1.9K vistas.  Oregon Health and Science University. Nuestro grupo está interesado en los circuitos neuronales y los mecanismos sinápticos que subyacen al procesamiento visual en la retina. El Laboratorio Morgans está investigando los mecanismos moleculares de adaptación a la luz en las células bipolares, y el Laboratorio Sivyer está interesado en cómo las neuronas internas de la retina contribuyen a la función de las células ganglionares. El acceso a las neuronas de la capa internuclear en la retina de montaje completo es un desafío ...

Video: Autor destacado: Uso de la técnica de retina dividida para mejorar el acceso y acelerar los experimentos 

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.