Obtención de organoides gástricos humanos previamente preparados para la elaboración de perfiles de pH. Para comenzar, conecte el electrodo de referencia al cable del electrodo de pH a través del conector. Luego, conecte el microelectrodo al amplificador y el amplificador a una PC conectada a tierra con el software a través de un cable USB.
Coloque el microelectrodo y el electrodo de referencia en agua desionizada para sumergir ambas puntas al menos un centímetro en el líquido. Llene los tubos cónicos de 50 mililitros con los tampones de calibración deseados. Con una toallita delicada de laboratorio, seque suavemente el tubo protector junto con el electrodo de referencia.
Después de abrir el software, en la pestaña de calibración, seleccione el cuadro Y-Zoom y luego configure la lectura de la señal del sensor en milivoltios. Empezando por los electrodos del tampón de pH 4,01, introduzca 4,01 como valor de pH conocido. Seleccione Agregar punto una vez que la lectura de milivoltios se estabilice, luego vuelva a colocar ambos electrodos en agua desionizada para enjuagarlos.
Después de repetir el proceso para el tampón de pH 9.21, haga clic en Agregar punto cuando la señal sea estable en alrededor de 83 milivoltios. Compruebe que los microelectrodos responden linealmente entre pH 4,01 y 9,21 para una curva de calibración de dos puntos. Coloque con cuidado el estuche de protección plano sobre el banco y retire el estuche con un movimiento rápido y rápido para quitar el microelectrodo.
Monte el microelectrodo en un micromanipulador y coloque el estereoscopio y el micromanipulador de manera que el microelectrodo pueda avanzar libremente hacia la placa de cultivo. Coloque la placa de cultivo que contiene los organoides para el perfilado. Fije ligeramente el electrodo de referencia a la pinza del soporte de anillo a la izquierda del estereoscopio.
Avance visualmente la punta del microelectrodo hasta que esté suficientemente sumergido en el medio. Una vez que la señal se haya estabilizado, registre tres lecturas de pH del medio. Luego, avance lentamente el microelectrodo en el ECM sin tocar ningún organoide.
Registre al menos tres lecturas de pH para calcular el promedio. Coloque el microelectrodo a lo largo del eje perpendicular a la superficie del organoide, haciendo suavemente una pequeña hendidura en la superficie del organoide basolateral sin penetrarla. Avance con cuidado el microelectrodo en el organoide y mida el pH luminal.
Una vez finalizado, proceda a medir el pH del siguiente organoide. Vuelva a colocar el electrodo a limpiar en su tubo de protección. Enjuague el electrodo en serie con agua desionizada, etanol y tampón.
Coloque el electrodo de referencia en un vaso de precipitados lleno de una solución de cloruro de potasio de tres molares. Rellene un capilar de vidrio de dos microlitros con aceite mineral estéril y cárguelo en un autoinyector de nanolitros controlado por micromanipulador. Finalmente, llénelo con una solución que contenga 0,02% de rojo de metilo y 150 milimolares de ácido clorhídrico y realice la inyección con 9,2 nanolitros de la solución.
La variación en el pH luminal entre 10 organoides en la misma placa de cultivo fue mínima, con mediciones consistentes alrededor de 8.16. El pH intraluminal en cinco líneas de organoides diferentes fue consistente dentro de cada cultivo, pero se observó una variabilidad significativa entre las líneas de organoides. El pH luminal del organoide fue consistentemente más bajo que los ECM, que a su vez fueron más bajos que el pH del medio, lo que sugiere que el pH luminal es fisiológicamente relevante y no está determinado únicamente por el entorno de cultivo circundante.
La inyección de rojo de metilo en la luz del organoide confirmó que tenía un pH superior a 6,2, lo que concuerda con las mediciones de los microelectrodos que mostraron un pH casi neutro.
