This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 and 25460137).

NOTA: Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética apropiados. 1. cultivo primario de fibroblastos humanos de pulmón <ol><li> Colección de tejido pulmonar: <ol><li> Obtener muestras de tejido de pulmón humano de la sala de operaciones quirúrgicas directamente. Recoger aproximadamente 1 cm 3 cuadras del tejido pulmonar canceroso y no canceroso, con la muestra no cancerosa recogido tan lejos de tumor posible. </li><li> Suspender las muestras en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,25 mg / ml de anfotericina B (medio libre de suero). Mantener las muestras en suspensión en 50 ml tubos estériles y traslado al laboratorio. NOTA: Los fibroblastos son altamente migratoria y proliferativa en comparación con otros tipos de células, tales como células epiteliales, endoteliales y células musculares lisas. El método de derivación se aprovecha de estas características de los fibroblastos, y outgrolas células del ala de las secciones de tejido son abundantes en los fibroblastos. Después de varios pases celulares, otros tipos de células no sobreviven y propagar en DMEM con suero bovino fetal al 10% (FBS), resultando en cultivos celulares de fibroblastos purificados. Las células podrían utilizarse 3-7 pasajes siguientes cultivo primario. </li></ol></li><li> Cultura explante y acondicionamiento de crecimiento externo celular: <ol><li> Realizar cultivo primario de fibroblastos utilizando un protocolo informó anteriormente con modificaciones 5. </li><li> En el laboratorio, colocar la muestra de tejido en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos sin medio de cultivo y se corta en pequeñas secciones ~ 2-3 mm de tamaño usando pinzas estériles y un bisturí. Durante este proceso, evitar hacer la sección seca, de lo contrario la eficiencia del crecimiento de la célula está alterada. </li></ol></li><li> La separación de la capa de células epiteliales y del tejido conectivo: <ol><li> Remoje las secciones de tejido cortado en medio de cultivo que contiene 2.000 UF / ml dispasa I y cultura durante 16 horas a 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Transferencia de las secciones de tejido a un plato, y separar la capa de células epiteliales del tejido conectivo adyacente. Procesar las secciones en un banco limpio para evitar la contaminación de microorganismos. NOTA: Si se necesita un cultivo primario de células epiteliales, realice el paso 1.3. Si sólo fibroblastos deben ser aislados, omita el paso 1.3 porque la cultura explante y celulares pasajes posteriores son desfavorables para las células epiteliales, que producen poblaciones de fibroblastos purificados. </li></ol></li><li> La unión de las secciones de tejido: <ol><li> Picar los tejidos en piezas de 1 mm utilizando dos escalpelos. Si las piezas no son lo suficientemente pequeños, se desprenden más fácilmente del plato, y las células no podrán superar en la superficie del plato. </li><li> Coloque pequeñas secciones de tejido de pulmón separados unos de otros para mantener un área vacía rodea a cada pieza. Hacer arañazos en la superficie de la placa de cultivo de tejidos utilizando una hoja de bisturí para facilitar la unión de secciones de tejido. NOTA: Rascarsetambién parece facilitar la derivación de células, proporcionando pistas a lo largo de la cual las células pueden migrar. <ol><li> Como alternativa, coloque trozos de tejido picado individualmente en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y cubrirlos con un cubreobjetos. Coloque la hoja de la cubierta a la superficie de la placa con grasa de silicona. </li><li> Coloque grasa de silicona en dos puntos 1.5 cm de separación, en cada pocillo utilizando un pasador estéril. Cobertura de las piezas de tejido mejora la eficacia del crecimiento de las células y la propagación de células después de varios pasajes. </li></ol></li></ol></li><li> Cultura explante subsiguiente: <ol><li> Añadir suavemente medio de cultivo para el plato antes de las secciones de tejido se secan, como consecuencia de células eficiente se pierde en su mayor parte si las muestras se sequen. No vierta el medio con demasiada rapidez como las secciones de tejido se separe. </li><li> Células de cultivo en DMEM con 10% de FBS. Utilice medio suficiente para cubrir sólo el tejido, pero no demasiado, que permite flotante, como la flotabilidad adicional promueve la separación de laplato. </li></ol></li><li> Pasaje de la célula: <ol><li> Maneje el medio de cultivo con cuidado en todo momento como movimientos repetidos de la placa de cultivo puede dar lugar al desprendimiento de las secciones de tejido. </li><li> Coloque las placas de cultivo en una incubadora a 37 ° C durante 5-7 días. Actualizar el medio cada dos días, y manejar las placas de cultivo mínimamente durante los cambios de medio. Los fibroblastos superan desde el borde de las secciones de tejido en las próximas semanas. NOTA: Después de ~ 2-3 semanas, los fibroblastos outgrowing casi alcanzan la confluencia, dependiendo de la cantidad de área de superficie. </li><li> Lavar las células con PBS 1x, y añadir 1 ml de tripsina I de la placa. </li><li> Después de tripsinización, separar las células usando 9 ml de DMEM suplementado con 10% FBS. Recoger las células suspendidas en el medio en un tubo de 10 ml, junto con las secciones de tejido. Después de la centrifugación para formar sedimentos celulares, resuspender los sedimentos resultantes en el nuevo medio. </li><li> Sembrar las células y las secciones de tejido en un nuevo callejónplato tura, momento en el que los tejidos fallan para insertarse en el plato, mientras que las células se adhieran y crezcan. Al día siguiente, retire los trozos de tejido que flotan por aspiración, y cambiar el medio. Fibroblastos adjuntos se propagan con culturas posteriores. </li></ol></li></ol> 2. tridimensional Co-cultivo de fibroblastos humanos de pulmón y células cancerosas <ol><li> Preparación de las células y reactivos: <ol><li> Utilizar Aproximadamente 2 x 10 5 células epiteliales y 2,5 x 10 5 fibroblastos por pocillo. Preparar el colágeno de tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampón de reconstitución (NaOH 50 mM, 260 mM NaHCO 3, mM HEPES 200), 5x DMEM, DMEM suplementado con 10% FBS para cultivo de fibroblastos, y un medio de co-cultivo 3D (una mezcla 1: 1 de medio de cultivo de fibroblastos y medio de cultivo para las células cancerosas). </li><li> A549 Cultura células de adenocarcinoma de pulmón, los fibroblastos y el co-cultivo 3D A549 en DMEM suplementado con 10% FBS. </li></ol></li><li> El colágeno gel formación: <ol><li> Lave fibroblastos cultivados en placa de 10 cm con 1x PBS, y añadir 1 ml de tripsina I de la placa. Después de tripsinización durante ~ 5 min a 37 ° C, separar las células usando 9 ml de DMEM suplementado con 10% FBS. Recoger las células suspendidas en el medio en un tubo de 10 ml y centrifugar ellos a 200-300 xg para formar sedimentos celulares. </li><li> Resuspender los sedimentos resultantes en 100% de FBS a una densidad de 5 x 10 5 / ml. </li><li> Preparar el gel de colágeno en el hielo. Enfriar los reactivos, pipetas y tubos en un refrigerador antes de la siguiente procedimiento. Incluso en el hielo, la mezcla solidifica en cierto grado, y el volumen total es menor que la suma de todos los componentes. </li><li> En cada pocillo, preparar el gel de colágeno mediante la mezcla de 0,5 ml de la suspensión de fibroblastos (2,5 x 10 5 células) en FBS, 2,3 ml de colágeno de tipo IA, 670 l 5x DMEM, y 330 l tampón de reconstitución. Permitir que los geles para ajustar fácilmente a temperatura ambiente. <ol><li> Vigorosamente pipeta para asegurarse a mi homogéneaxture. Evitar la creación de burbujas durante el proceso de pipeteado. </li></ol></li><li> Añadir la mezcla (3 ml) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se deja gelatinizar en la incubadora a 37 ° C sin perturbaciones durante 30-60 min. </li></ol></li><li> Cultivo de células de cáncer en el gel de colágeno: <ol><li> Realizar co-cultivo tridimensional usando un protocolo informó anteriormente con modificaciones 6. </li><li> Resuspender las células cancerosas en el medio de co-cultivo 3D (o en DMEM con 10% FBS en el caso de las células A549) a una densidad de 1 x 10 5 / ml. </li><li> Verter 2 ml de la solución de células resuspendido (2 x 10 5 células) sobre la superficie de cada gel. Modificar el número de células de las células cancerosas o fibroblastos en co-cultivo dependiendo de las condiciones experimentales. </li></ol></li><li> Gel contracción: <ol><li> Incubar geles durante la noche a 37 ° C de modo que las células cancerosas pueden adherirse a la gel de colágeno. Separe cada gel, y generar una &quot;cultura flotante&quot; en cada pozo of la placa de 6 pocillos. NOTA: Mediante el uso de una cultura flotante, diversos cambios en el tamaño de gel son inducidas por la tensión mecánica y la degradación de colágeno, que están mediadas por la interacción celular entre co-cultivaron células cancerosas y fibroblastos. </li><li> Utilice un ángulo 21 G aguja o pequeña espátula para separar cada gel desde el borde del pozo. Cada 2-3 días, refrescan los pocillos con 2 ml de medio de cultivo conjunto 3D. Medir el tamaño de cada gel cada día durante 5 días. </li></ol></li><li> Análisis de geles de colágeno: <ol><li> Mida el contenido de colágeno de cada gel utilizando métodos de cuantificación de colágeno, tales como el ensayo Sircol. Realizar análisis transcriptómica o RT-PCR cuantitativa después de recoger el ARN de los geles 5. </li></ol></li></ol> 3. Aire líquido Interfaz cultura y la invasión de ensayo <ol><li> Después de cultivar los geles de colágeno a 37 ° C durante 5 días, exponga los geles contratados a la atmósfera que los coloca en una malla (70 micras de tamaño de poro) en el nuevo 6-placas de pocillos. Hacer la malla de los tamices de células disponibles comercialmente utilizados para citometría de flujo. </li><li> Llenar suavemente cada pocillo con 11 ml de medio de co-cultivo 3D. </li><li> Coloque los geles sobre la malla con una cuchara estéril y retire cualquier medio restante de los geles. En esta condición, se sumergen geles en el medio mientras exponer la superficie superior del gel al aire. Definir esta condición cultura como interfase aire-líquido. NOTA: Después de 5-7 días de mantenimiento de la cultura interfase aire-líquido a 37 ° C en la incubadora, las células cancerosas invasivas migrar en el gel. Dependiendo del tipo de célula y como resultado de interacciones celulares, grados variables de cambio morfológico celular en las células cancerosas son inducidas por la cultura interfase aire-líquido. </li><li> Para la evaluación histológica, fijar el gel en solución de formalina durante la noche a temperatura ambiente y embeber en parafina. Teñir secciones verticales (4 m) con hematoxilina y eosina (H &amp; E). Realizar análisis inmunohistoquímico on las secciones 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts-a+key+host+cell+type+in+tumor+initiation,+progression,+and+metastasis.">Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis.</a> Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).</li><li>Augsten, M., H&#228;ggl&#246;f, C., Pe&#241;a, C., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digest+on+the+role+of+the+tumor+microenvironment+in+gastrointestinal+cancers.">A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers.</a> Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).</li><li>Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+as+Another+Polarized+Cell+Type+of+the+Tumor+Microenvironment.">Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment.</a> Front. 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Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).</li><li>Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+keratinocyte+stratification+by+a+dominant+negative+JunB+mutant+without+blocking+cell+proliferation.">Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation.</a> Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. 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Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li><li>Navab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+gene-expression+signature+of+carcinoma-associated+fibroblasts+in+non-small+cell+lung+cancer.">Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).</li><li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblasts+from+human+colon+tumors+shows+specific+prognostic+gene+expression+signature.">Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature.</a> Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).</li><li>H&#228;ggl&#246;f, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+PDGFRbeta+expression+in+prostate+tumors+and+non-malignant+prostate+tissue+predicts+prostate+cancer+survival.">Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival.</a> PLoS One. 5 (5), e10747 (2010).</li><li>Saito, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forkhead+box+F1+regulates+tumor-promoting+properties+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

CAF forman un componente importante de la ECM que rodea las células del cáncer y no sólo proporcionan un andamio para el tumor, pero también participan activamente en el desarrollo del tumor 7. La acumulación de pruebas revela el impacto de la CAF o sus moléculas relacionadas en el eventual pronóstico, destacando el papel fundamental de la progresión tumoral mediada por CAF 8. En el estudio anterior, hemos empleado el método consecuencia de aislar CAF pulmón <...

Cancer tissue can be perceived as a type of organ, which evolves through close interactions between the cancer and the tumor stromal microenvironment, composed of cancer-associated fibroblasts (CAFs), immune cells, tumor vessels and the extracellular matrix (ECM). CAFs are the major source of soluble factors (cytokines, growth factors and chemokines) that exert mitogenic, pro-migratory and pro-invasive effects on cancer cells. They also stimulate tumor vessel formation and recruit precursor cells, such as bone marrow-derived cells (BMDC). Activated CAFs are involved in the production and remodeling of the ECM, thereby promoting the growth and spread of cancer cells1. CAFs also provide a niche that facilitates tumor cell colonization and metastasis and are capable of conferring stem cell phenotypes onto neighboring cancer cells. Pathological observations suggest that stromal reactions or fibrotic changes in cancer tissues are indicative of a poor prognosis. Recent studies have also demonstrated that tumor stromal features, such as the gene signature, can predict patient prognosis. Furthermore, CAF-derived factors can modulate sensitivity to chemotherapy, highlighting the role of CAFs in determining drug sensitivity and resistance2.
As CAFs play a multifaceted role in the promotion of tumor progression through signaling pathways that mediate interactions between CAFs and different cell types within the tumor microenvironment, they have attracted increasing attention as novel targets for cancer therapies. The heterogeneity of the cell populations within the cancer microenvironment presents an obstacle for targeting CAFs. Several markers for CAFs have been proposed, such as &#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA), fibroblast activation protein (FAP), and fibroblast specific proten-1 (FSP-1: also called S100A4); however, these molecular markers are not specific for distinguishing CAFs from other cells present in non-cancerous tissues3. Therefore, further studies are needed to obtain more knowledge about the specific properties of CAFs. To this end, it is informative to characterize primary cultured CAFs compared with patient-matched normal fibroblasts.
Recently, analyses on patient-derived CAFs have been reported in several cancer types, revealing unique gene expression patterns and cell behaviors compared with fibroblasts derived from non-cancerous tissues. Using isolated CAFs from human lung cancer tissues, we developed a three-dimensional co-culture method, enabling us to evaluate the properties of lung CAFs. In this model, we investigated the effects of the CAFs on lung cancer cell invasion, proliferation and collagen gel contraction, which experimentally recapitulated the tumor-promoting roles of lung CAFs4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1035">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:267px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:471px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">DMEM</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:471px;">D5796</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FBS</td>
			<td style="width:297px;">GIBCO</td>
			<td style="width:471px;">10437</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Collagen type IA</td>
			<td style="width:297px;">Nitta gelatin Inc.</td>
			<td style="width:471px;">CELL-1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Reconstitution buffer</td>
			<td style="width:297px;">Nitta gelatin Inc.</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cover slip</td>
			<td style="width:297px;">NUNC</td>
			<td style="width:471px;">174934</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Silicone grease</td>
			<td style="width:297px;">Dow Corning Toray</td>
			<td style="width:471px;">High vacuum grease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dispase I</td>
			<td style="width:297px;">WAKO</td>
			<td style="width:471px;">386-02271</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">6-well plate</td>
			<td style="width:297px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:471px;">353046</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cell strainer (70 &#956;m)</td>
			<td style="width:297px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:471px;">352350</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional co-culture model for tumor-stromal interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Este método de co-cultivo, imitando el microambiente tumoral, es una herramienta útil para investigar las interacciones entre las células cancerosas y los fibroblastos embebidos en geles de colágeno. En el estudio anterior, tres parámetros fueron evaluados en este modelo experimental: la contracción de gel de colágeno, la invasión de células de cáncer y el cambio morfológico. Proliferación de las células del cáncer se estimó utilizando también Ki67 inmunoticción 4. Muestras de tejido pulmonar...

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Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

three-dimensional-co-culture-model-for-tumor-stromal-interaction

Research

JoVE Journal

Medicine

17.2K vistas.  The University of Tokyo. Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.