Este protocolo permite una visualización de estructuras tridimensionales en el riñón completo, lo que puede conducir a descubrimientos innovadores en la investigación renal al proporcionar una perspectiva macroscópica. La tinción de órganos de montaje completo es un desafío debido a la dificultad en la penetración de anticuerpos. Este protocolo ha demostrado la tinción de alta calidad y montaje completo de los riñones por los anticuerpos.
Para comenzar, realice la fijación por inmersión inmediatamente después de la fijación de perfusión y el muestreo renal, sumergiendo el riñón en paraformaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Dé tres lavados usando PBS durante dos horas cada uno. Realice el proceso de decoloración y deslipidación sumergiendo el riñón fijo en siete milímetros de 50% CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 mililitros, con agitación suave a temperatura ambiente.
Después de seis horas, sumerja el riñón en siete mililitros de CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 milímetros, con una agitación suave a 37 grados centígrados durante cinco días. Refresque CUBIC-L todos los días. Una vez que se complete la decoloración y la deslipidación, use una cuchara dispensadora para el manejo de muestras y lave el riñón tres veces con PBS a temperatura ambiente durante dos horas.
Inmunoteñir el riñón deslipidado en anticuerpos primarios diluidos en solución tampón de tinción, con agitación suave en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante siete días. Luego, lave el riñón con 0.5% Triton X-100 en PBS, también conocido como PBST, a temperatura ambiente durante un día. Para la tinción secundaria de anticuerpos, trate el riñón con anticuerpos secundarios en el tampón de tinción, en la oscuridad, con una agitación suave a 37 grados centígrados durante siete días.
Arregle la tinción con un lavado PBST a temperatura ambiente durante un día. Después de la fijación, sumerja el riñón en formaldehído al 1% en PB durante tres horas y lávelo con PBS a temperatura ambiente durante seis horas. Realice la coincidencia del índice de refracción sumergiendo el riñón en siete mililitros de 50% CUBIC-R + en un tubo de fondo redondo de 14 mililitros con agitación durante un día, seguido de un tratamiento con siete mililitros de CUBIC-R + con agitación a temperatura ambiente durante dos días.
Con la ayuda del método de tinción inmune, los nervios y arterias simpáticos en un riñón completo se visualizaron en imágenes renales 3D. Además, se visualizaron nervios simpáticos renales anormales después de la lesión por isquemia-reperfusión. Este protocolo también facilitó la visualización de los nervios simpáticos en todo el bazo.
El proceso de cuantificación de datos para la tinción inmunofluorescente tridimensional se muestra aquí. Además, los conductos colectores, el segmento S1 de los túbulos proximales y los glomérulos se visualizaron con éxito en todo un riñón. La glomerulomegalia suprimida, resultante de la administración de fármacos en las primeras etapas de la enfermedad renal diabética, también se visualizó en imágenes 3D.
Este protocolo puede etiquetar la molécula específica dentro de un riñón completo. Por lo tanto, los investigadores pueden analizar la alteración de la estructura en la vasculatura o encontrar eventos raros en los tejidos renales.
