Preparación de secciones de tejido pulmonar de ratón para la tinción con isolectina B4 para evaluar la densidad microvascular pulmonar

Para comenzar, coloque el tejido pulmonar del ratón en paraformaldehído al 4%, que es 10 veces el volumen del tejido. Después de tres horas de fijación, separe los cinco lóbulos pulmonares e inserte los lóbulos craneal, medio y accesorio del pulmón derecho por separado, orientándose en la dirección de la conexión vertical del lóbulo al bronquio. A continuación, corte el lóbulo caudal del pulmón derecho en dos piezas a cuatro milímetros de izquierda a derecha en la dirección perpendicular a la conexión pulmón-lóbulo-bronquio, e incruste las rodajas en un bloque de cera, con la superficie de corte hacia arriba.

Para hacer tres cortes en el lóbulo pulmonar izquierdo, corte transversalmente por encima de la unión bronquial principal, dos milímetros por debajo de la parte superior. Haz el segundo corte transversalmente por encima de la unión bronquial principal, cinco milímetros por debajo de la parte superior. Haz el tercer corte al final del lóbulo, ocho milímetros por debajo de la parte superior.

Después de desechar la pieza superior de tejido, encierre las tres piezas restantes en un bloque de cera, con la superficie cortada hacia arriba. Después de la refijación, enjuague el bloque de tejido con agua corriente durante 15 minutos. Sumerja secuencialmente el tejido en las concentraciones crecientes de etanol, seguidas de xileno y cera blanda.

Llene un molde con una cantidad adecuada de parafina líquida y, con pinzas, coloque el tejido en el marco de inclusión en el centro. Coloque el molde y el tejido en el área de congelación de la máquina de incrustación. Cuando la parafina comience a blanquearse ligeramente, coloque rápidamente el marco de inclusión descubierto en la parte superior del molde y realice la segunda inyección de cera, sellando los orificios en la parte inferior del marco de incrustación.

Luego transfiera todo el molde a la mesa de congelación. Después de asegurar el bloque de cera en la cortadora, recórtelo para revelar una superficie de corte lisa y plana. Gire la manivela de la rueda del micrótomo para cortar rodajas con un grosor de cuatro micrómetros.

Coloque suavemente las secciones eliminadas en la superficie del agua de forma secuencial. Una vez que las secciones estén completamente extendidas, separe las piezas rotas en las uniones entre cada sección. Incline un portaobjetos de vidrio debajo de la sección y, al contacto, levante lenta y uniformemente el portaobjetos de la superficie del agua con un movimiento vertical.