Tinción de las secciones de tejido pulmonar de ratón con isolectina B4 y DAPI para visualizar la densidad microvascular pulmonar

Para comenzar, obtenga una rebanada de tejido pulmonar de ratón incrustada en parafina y colóquela en un horno a 65 grados centígrados durante 60 minutos. Para la tinción, sumerja el portaobjetos con la sección de tejido secuencialmente en los frascos de tinción que contienen las soluciones adecuadas. Diluir la solución de recuperación de antígeno de citrato de sodio modificada 50 veces con agua desionizada.

Después de precalentar el extracto de antígenos en el microondas a alta potencia, coloque el portaobjetos durante 15 minutos para que hierva. Después de que el portaobjetos se enfríe a temperatura ambiente, lávelo dos veces con PBS durante cinco minutos cada una. A continuación, permeabilice el tejido con tritón al 0,25% dos veces durante 10 minutos cada una.

Rodee el tejido con una pluma de inmunohistoquímica e incube el portaobjetos con 5 % de BSA a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, diluya la isolectina B4, o IB4, con 1%BSA en una proporción de 1 a 50. Después de eliminar el exceso de agua, incubar la sección de tejido con 50 a 100 microlitros del IB4 diluido durante la noche a cuatro grados centígrados.

Lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada uno y permeable con 0,25%triton durante 10 minutos. A continuación, incubar la sección de tejido con 50 a 100 microlitros de DAPI a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de tres lavados de PBS, aplique una gota de medio de montaje anti-decoloración a la guía, evitando la exposición a la luz.

Monte el portaobjetos secado al aire bajo un microscopio de fluorescencia para capturar imágenes del núcleo y las señales objetivo. Este protocolo permite la localización precisa y la observación de la microvasculatura pulmonar utilizando IB4 para teñir células microendoteliales en diferentes lóbulos pulmonares de ratón bajo un microscopio de fluorescencia.