Para comenzar, prepare la solución de Selenoprotein utilizando un ensayo de desplazamiento térmico o un tampón TSA. dispense la proteína, las moléculas pequeñas y el colorante naranja SYPRO a los pocillos apropiados de una placa de 384 pocillos. Cubra la placa con una película adhesiva ópticamente transparente y gire brevemente la placa a 1.000 g durante un minuto en una centrífuga.
A continuación, coloque la placa en una máquina de PCR en tiempo real y prográmela para que mantenga la muestra a 20 grados centígrados durante dos minutos, seguido de un aumento de 0,5 grados en la temperatura por minuto hasta 95 grados centígrados. Exporte los datos de la máquina RT PCR para unidades de fluorescencia relativa o RFU con respecto a la temperatura. Utilizando el software de su elección, extraiga y trace puntos de datos hasta la intensidad más alta medida para cada curva de fusión.
Determine la temperatura de fusión con el ajuste sigmoidal de Boltzmann para que los datos determinen la temperatura de fusión o Tm. Las curvas de desnaturalización térmica indicaron un aumento de cuatro grados Celsius en la estabilidad térmica de Escherichia coli SelO en presencia de ATP con iones de magnesio y un aumento de 12 grados Celsius en el mismo para ATP con iones de manganeso. Sin embargo, no hubo cambios en la estabilidad térmica tras la incubación con UTP, lo que indica que Escherichia coli SelO puede no exhibir una unión detectable a UTP. Los controles sin proteína, así como los controles sin colorante, tenían una señal de fluorescencia baja, que no respondía al aumento de temperatura.
