Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Unser Ziel ist es, die biochemische Aktivität von Proteinen mit unbekannten Funktionen zu untersuchen. Die Bindung von Co-Faktoren ist nicht nur für die Aktivität einiger Proteine unerlässlich, sondern kann auch deren thermische Stabilität verändern. Eine praktische Anwendung dieses Phänomens besteht darin, die Änderung der thermischen Stabilität, gemessen an der Schmelztemperatur des Proteins, zur Analyse der Ligandenbindung zu nutzen.

Der Thermoshift-Assay ist ein vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung von Proteininteraktionen mit potenziellen Co-Faktoren oder Medikamenten und zur Identifizierung stabilisierender Bedingungen für die Kristallographie. Zu den Vorteilen gegenüber anderen Screening-Methoden gehören die relativ einfache Einrichtung und der hohe Durchsatz mit 96- oder 384-Well-Platten. Selenoprotein O oder SelO ist eine evolutionär konservierte Pseudokinase, die Adenosinmonophosphat von ATP auf Proteinsubstrate in einer posttranslationalen Modifikation überträgt, die als AMPylierung bekannt ist.

In diesem Protokoll verwenden wir TSA, um die Nukleotid- und Metallbindung an SelO zu analysieren.