Para empezar, coloque el ratón anestesiado en un aparato estereotáxico. Haga una incisión continua a lo largo de la línea media del cuero cabelludo con unas tijeras quirúrgicas y corte parte del cuero cabelludo para exponer la superficie del cráneo. Realice la craneotomía en la región especificada con el micro taladro y establezca cuatro puntos como borde.
Deje de perforar cuando el tejido cerebral se vuelva visible. Use el panel de control para configurar el inyector para inyectar 80 nanolitros del virus. Haga clic en el botón Inyectar en el panel de control para inyectar el virus en el giro dentado a un caudal de 1 nanolitro por segundo.
Para succionar el tejido cerebral, gire la punta de la aguja roma muy por encima del tejido cerebral y presione suavemente para facilitar la aspiración. Enjuague continuamente con solución salina fría durante la succión para mantener una visión clara del cerebro. Observe de cerca las características del tejido para controlar la profundidad de la aspiración.
El tejido cortical es de color rosa pálido. El cuerpo calloso inferior aparece como tejido fibroso blanco. Y la capa CA1 del hipocampo es de color rojo oscuro y gris.
Detenga la succión cuando la superficie del tejido se vuelva lisa y quede expuesta una gran área de CA1. Mueva el soporte conectado a la lente de sonrisa por encima del orificio perforado. Cuando la lente de la sonrisa entre en contacto con la superficie del tejido cerebral, ajuste el eje Z a cero.
Inserte la lente de sonrisa en el orificio en el eje ventral dorsal menos 1,32 milímetros. Deje reposar el soporte durante 5 a 10 minutos. Luego, levante el soporte y enjuague el orificio con solución salina.
Con una aguja, aplique la resina ultravioleta alrededor de la lente Grin. Ilumina la zona con luz ultravioleta durante 15 segundos para asegurarte de que la resina se solidifique. Retire con cuidado el soporte de la lente de la sonrisa.
Cubre todo el cráneo expuesto con resina ultravioleta. Coloque la placa de la cabeza en el cráneo en la posición adecuada. Ilumina todo el cráneo y la placa de la cabeza con luz ultravioleta durante 15 segundos.
Cubra la lente de sonrisa expuesta con una tapa protectora impresa en 3D. Fije la tapa a la placa principal con tornillos M1.6. Encienda el software de control del miniscopio y haga clic en Seleccionar archivo de configuración.
A continuación, seleccione vscode y, a continuación, Archivos de configuración de usuario. Ahora, haga clic en Ejecutar. Luego, deslice el botón de encendido LED para ajustar el brillo.
Deslice el botón de ajuste de enfoque para establecer el valor cerca de cero. Coloque la placa base en el miniosciloscopio y reajuste la posición del miniosciloscopio para obtener un campo de visión con buena calidad de imagen. Aplique con cuidado la primera capa de material de base de la dentadura postiza alrededor de la placa base del mini visor.
Una vez que la primera capa del cemento se endurezca, aplique una segunda capa de cemento desde la placa base hasta la placa principal. Después de que todo el material base de la dentadura postiza se endurezca, afloje el tornillo de fijación y separe el miniosciloscopio de la placa base. Coloque la tapa de la placa base en la placa base para proteger la lente de sonrisa expuesta y apriete el tornillo de fijación.
Después de la creación de imágenes, convierta los datos de imagen de AVI a formato HDF5. Aplique la corrección de movimiento no rígida y reduzca la resolución de la película corregida por movimiento. Aplique extract en los datos de muestreo descendente para identificar señales de una sola celda.
A continuación, aplique la comprobación de celda y seleccione manualmente las celdas potenciales. Haga clic en Guardar datos antes de cerrar la ventana de verificación de celda. Por último, guarde los archivos de datos.
En las imágenes de calcio in vivo fallidas, no se observaron células activas en el campo de visión de la imagen. Las imágenes de calcio in vivo exitosas mostraron menos de 10 células activas sin vasos sanguíneos obvios. Más de 50 células activas con vasos sanguíneos visibles.
Y cientos de células activas con vasos sanguíneos claros. Las células individuales extraídas de un registro exitoso de imágenes de calcio in vivo se superpusieron en el campo de visión con trazas de calcio representativas mostradas. La posición de la expresión de GCaMP6F y el seguimiento de la lente de la sonrisa se verificaron en el corte de cerebro del ratón.
