Esta técnica se puede utilizar para avanzar en nuestra comprensión del manejo del calcio en las neuronas, y cómo el calcio compartimentado puede regular diferentes mecanismos importantes para la función neuronal in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite obtener imágenes in vivo rápidas de mayor resolución en condiciones fisiológicas en C.elegans que pueden combinarse con otras herramientas fluorescentes. Esta técnica podría proporcionar información sobre el mecanismo que regula la señalización del calcio en las neuronas en muchos contextos diferentes.
Por ejemplo, durante el envejecimiento, lesión neuronal y neurodegeneración. Demostrando este procedimiento estará Ennis Deihl, técnico de investigación. Kaz Knight, candidato a doctorado, y Rachel Doser, investigadora postdoctoral de mi laboratorio.
Comience clonando vectores de expresión que contengan un promotor seguido de un indicador de calcio y tres UTR principales de elección. Crear cepas transgénicas de C.elegans mediante microinyección de una mezcla de ADN que contiene el ADN de rescate Lin-15 plus en el transgén indicador de calcio en la gónada de un C.elegans adulto de un día de edad. Mantenga los gusanos padres inyectados a 20 grados centígrados hasta que la progenie F1 alcance la edad adulta.
Seleccione adultos transgénicos mediante la detección de la ausencia del fenotipo multivulva. Eso indica la expresión de la matriz cromosómica adicional que contiene el indicador de calcio. Clonalmente pasan progenie F1 adulta que no tiene el fenotipo multivulva.
Realizar experimentos sobre generaciones posteriores de las cepas transgénicas con una expresión óptima del indicador de calcio. Utilice un microscopio capaz de obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Localice el gusano bajo un objetivo de bajo aumento y luego cambie a un objetivo de gran aumento para localizar las neuronas.
Adquiera las imágenes utilizando una cámara ultrasensible capaz de adquirir imágenes rápidamente a más de 50 FPS. A continuación, utilice un filtro de emisión estándar para el indicador de calcio. Agregue un corrector de deriva Z para la adquisición de flujos de imágenes de más de 10 segundos.
En un tubo de cultivo de vidrio de 13 por 100 milímetros, prepare tres mililitros de agar al 10% disolviendo agar de grado molecular en M9 y microondas durante varios segundos. Para hacer las almohadillas de agar, primero, prepare dos portaobjetos agregando dos capas de cinta de laboratorio. Luego coloque un portaobjetos de microscopio entre los dos portaobjetos.
Corte la punta de una pipeta de 1000 microlitros y utilícela para pipetear una pequeña gota de agar en el centro del cubreobjetos. Aplana el agar presionando otro deslizamiento hacia abajo encima del agar. Después de enfriar, corte el agar en un disco pequeño con la abertura de un tubo de 10 mililitros y luego retire el agar circundante.
A continuación, prepare la solución de laminación de gusanos disolviendo el polvo de muscimol en M9 para crear una culata de 30 milimolares. Diluya el material en una proporción de uno a uno con perlas de poliestireno para hacer la solución de laminación. Para posicionar el gusano para la obtención de imágenes, primero, coloque 1.6 microlitros de la solución rodante en el centro de la almohadilla de agar.
Luego, usando un pico de gusano preferido, transfiera un gusano de la edad deseada a la solución de laminación en la almohadilla de agar. Espere unos cinco minutos para que el muscimol reduzca el movimiento del gusano y luego deje caer un deslizamiento de cubierta de 22 por 22 milímetros sobre la almohadilla de agar. Para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso ventral, enrolle el gusano deslizando ligeramente el resbalón de la cubierta.
Para montar el gusano en el microscopio, coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos. Encuentre el gusano utilizando un objetivo de baja ampliación en campo claro. Luego cambie a un objetivo 100x y localice la neurita AVA utilizando la iluminación del GCaMP o mito GCaMP con el láser de imágenes de 488 nanómetros.
Para imágenes GCaMP in vivo, ajuste el láser de imágenes en los ajustes de adquisición hasta que la fluorescencia GCaMP de albahaca esté en el rango medio del rango dinámico de la cámara y ajuste el tiempo de exposición a 20 milisegundos. Después de localizar la neurita AVA utilizando la fluorescencia GCaMP con un aumento de 100 veces, configure el corrector de deriva Z e inicie el enfoque automático continuo. Corrija manualmente el plano focal según sea necesario antes de obtener imágenes.
Adquiera un flujo de imágenes con un aumento de 100 veces. Usando este protocolo, el calcio citoplasmático se midió con alta resolución temporal y espacial. La expresión celular específica de GCaMP6F en las interneuronas de comando AVA glutamatérgico reveló una propagación direccional de la afluencia de calcio.
La cuantificación subcelular de la fluorescencia GCaMP6F mostró que el inicio de la afluencia de calcio se retrasó en una porción de la neurita ubicada a solo 10 micrómetros de distancia. Además, las estructuras dendríticas similares a la columna vertebral encontradas a lo largo de la neurita AVA mostraron destellos en la fluorescencia GCaMP6F que ocurrieron independientemente de la activación de la neurita y no condujeron a una propagación de la afluencia de calcio. Además, los niveles relativos de calcio se midieron en las mitocondrias individuales en neuritas individuales utilizando una cepa de gusano con una expresión específica AVA del indicador de calcio localizado de la matriz mitocondrial mito GCaMP.
Los resultados mostraron la absorción sincrónica de una cantidad relativamente grande de calcio en un subconjunto de mitocondrias. Específicamente, la absorción de calcio en algunas mitocondrias estaba sincronizada, mientras que las mitocondrias vecinas no parecían absorber calcio. Del mismo modo, los subconjuntos de mitocondrias mostraron una rápida absorción y liberación de pequeñas cantidades de calcio.
Esto también parecía ser sincrónico, pero sólo para un subconjunto de mitocondrias. La velocidad y las manipulaciones finas son esenciales para posicionar a los animales y retener la función neuronal. La salud animal también es primordial.
Incluso un poco de hambre es problemático. La parte más difícil de aprender es la rápida orientación de los animales para la microscopía confocal sin daños. Mi consejo es mucha práctica y buenos controles.
Este protocolo podría aplicarse a experimentos en los que se libera calcio de otras ubicaciones subcelulares en neuronas, otras neuronas o células distintas de las neuronas en C. elegans. Debido a que este enfoque en C. elegans deja a los animales intactos, es posible abordar preguntas sobre la regulación del manejo del calcio subcelular in vivo en neuronas individuales de un sistema nervioso completo.
