La aceituna inferior es la parte más ventral de la médula, y por lo tanto es extremadamente difícil de alcanzar en un animal vivo. Aquí, presentamos un protocolo para exponer el tronco cerebral del ratón adulto desde el lado ventral, y usamos lentes GRIN para registrar la actividad neuronal en las neuronas de olivo inferiores que expresan sensores de calcio. Este método evita daños en el tronco encefálico crítico para la vida y permite investigaciones sobre patrones de actividad espacial-temporales e integración de entrada en la aceituna inferior.
Dado que la operación se realiza en la región compleja de la garganta con muchas estructuras vitales, es esencial que sea realizada por un investigador con habilidades quirúrgicas de alto nivel. Prepare un tubo de intubación cortando una hendidura de 5 a 6 milímetros de largo y 0,8 milímetros de ancho de la punta de un catéter de calibre 20. Prepare una aguja roma y curva cortando la punta, lije la superficie de fractura y dóblala con el alicate.
Esto se utilizará para apoyar una tráquea durante la traqueotomía. Diluir 15 miligramos por mililitro de ketamina con solución salina al 15% Montar herramientas de cirugía y consumibles. Establezca la almohadilla de calefacción a 38 grados Celsius.
Gire la nosecone 180 grados horizontalmente en el marco estereotáxico. Pesar el ratón cuya aceituna inferior fue previamente transfectada por GCaMP6s portadores de virus, y calcular la cantidad de ketamina diluida para inyección. Prellene la caja de inducción con isoflurano al 5%, y anestesiar el ratón.
Monte el ratón en el marco estereotáxico, lado ventral hacia arriba. Afeitarse la garganta del ratón y el área del muslo. Retire el vello residual con crema de depilación.
Aplicar tópicamente jalea de xilocaína en la piel de la garganta. Monitoree la temperatura del ratón con un sensor térmico rectal. Inyecte un mililitro solución salina precalentada por vía intraperitoneal.
Evaluar la profundidad de la anestesia por un fuerte pellizco en los dedos de los dedos de los dedos de los miembros posteriores. No se debe evocar ninguna respuesta detectable. Haga una incisión vertical en la piel de la garganta a lo largo de la línea media.
Separe la piel del cuello de las vísceras debajo de ella usando el método de disección contundente y corte la piel. Libere las glándulas salivales del tejido conectivo, y voltéeelas lateralmente para exponer la tráquea músculo-cubierta esternotiroides. Inyectar por vía intraperitoneal la primera dosis de ketamina diluida a cinco mililitro por kilogramo de peso animal.
Divida cuidadosamente el músculo esternotiroideo a lo largo de la línea media con la punta de un pórceps fino para exponer la tráquea. Desprenda la tráquea de los vasos sanguíneos y del esófago con el fórceps usando método embotado de la disección. Inyecte una segunda dosis de ketamina diluida a 2,5 mililitros por kilogramo de peso animal.
Inserte de manera transversal una aguja roma debajo de la tráquea. Levante la tráquea con la aguja roma. Haga que el hilo de sutura vaya alrededor del tercer anillo de tráquea, caudal de la glándula tiroides, con una aguja de medio círculo.
Haga cuatro lazos del instrumento en este anillo. Perfore la piel del pecho con la misma aguja de semicírculo y conduzca el hilo a través de la piel. Levante suavemente la tráquea con el hilo y corte la tráquea caudal a la glándula tiroides.
Tire de la tráquea hacia la piel del pecho. Levante la abertura de la tráquea agregando un pequeño pedazo de esponja quirúrgica debajo de ella. Retire cualquier líquido restante dentro de la punta de apertura de la tráquea con una tira delgada de tejido de limpieza.
Cambie el flujo de isoflurano de la nosecona estereotáxica al tubo de intubación. Inserte el tubo de intubación en la tráquea. Asegúrese de que parte de la hendidura en el tubo permanezca fuera de la tráquea para permitir la respiración.
Fije la tráquea a la piel del pecho del ratón haciendo tres a cuatro lazos del instrumento. Ate la tráquea con el hilo de sutura para asegurar el tubo de intubación. Corte el músculo esternotiroideo a lo largo de las fibras musculares con las medidas de control del órceps fino.
Corte la parte aislada con las tijeras de resorte. Libere cuidadosamente la tráquea y la laringe sobrantes del músculo para minimizar el daño en los vasos sanguíneos en el músculo. Retire la tráquea y la laringe sobrantes.
Libere el esófago del tejido unido con fórceps y córtuelo con tijeras de resorte. Retire el músculo longitudinal que cubre el tronco encefálico y el arco ventral del atlas. Retire el músculo que cubre el arco ventral del atlas y el tubérculo anterior.
Cortar los arcos ventrales del atlas con el rongeur. Retire el tubérculo anterior del atlas. Extraiga la sangre y el líquido para ver el agujero magno y el tronco encefálico.
Expanda el foramen magnum eliminando el hueso occipital con el rongeur. Retire el cartílago y pelar cuidadosamente la capa perióstico de la duramadre con los pórceps finos para tener una visión clara del tronco encefálico ventral. Sujete el sensor spO2 en el muslo del ratón para controlar los signos vitales como la frecuencia cardíaca, la saturación de oxígeno y la frecuencia respiratoria.
Monte la lente GRIN en la varilla de implantación. Limpie la lente cuidadosamente con un 70% de tejido de limpieza empapado en etanol. Fije la varilla de implantación en el marco estereotáxico y monte el microscopio en miniatura en la varilla de implantación.
Agregue varias gotas de solución salina en el área del tronco encefálico para la inmersión de la lente GRIN. Acércate al tronco encefálico con la lente GRIN. GCaMP6s que expresan neuronas de oliva inferiores en el área superficial se pueden encontrar en una región en forma de rectángulo, alrededor de 0.5 a 1.7 milímetros rostrales al atlas restante, y alrededor de 2.6 a 1.1 milímetros laterales a la línea media.
Encienda el LED azul de excitación en el microscopio en miniatura para localizar las neuronas de oliva inferiores transfectadas GCaMP6s. Las neuronas muestran diferente intensidad de fluorescencia basal debido a varios GCaMP6s nivel de expresión. El cambio de nivel de calcio de la somata de la neurona oliva inferior circundada en el video de la izquierda nos mostrará delta F dividido por F trazas a la derecha.
Aunque el ratón se mantiene caliente e hidratado, inevitablemente se debilitará por la anestesia prolongada y la cirugía. Es esencial mantener la duración de la cirugía corta para que la condición física del ratón sea buena para la grabación. Un investigador experto puede terminar la cirugía en 70 minutos.
Este método, con modificaciones, se puede utilizar para estudiar otras regiones adyacentes del médula oblonga ventral.
